E3 ubiquitin ligase GRAIN WIDTH 2 regulates seed size by mediating EXLA1 degradation in rice

Abstract

알곡수, 꽃차례수, 알곡무게는 벼 수량의 3대 구성요소로 벼 육종에 있어 수량은 꽃차례당 알곡수, 식물개체당 적정 수준의 꽃차례와 그에 따른 알곡무게의 증가에 의해 좌우된다. 작물들의 게놈 분석을 통하여 작물 수량에 영향을 미치는 벼 종자크기에 관여하는 다양한 유전자들의 분석이 가능하게 되었다. 종자 크기는 꽃차례당 알곡수, 식물 개체당 꽃차례수 그리고 천립중으로 산출되는 곡물 수량에 주요한 특성으로, 생물학적, 비생물학적 그리고 유전적 요인에 많은 영향을 받는다. GW2, GS3, GW5, GIF1, GL3, GS5, GW8 그리고 HGW의 유전자들이 종자크기에 관여하고 있으나, 이들의 작용기작은 아직 밝혀지지 않았다. 따라서 본 연구는 종자크기를 줄이는 RING 유형 E3 라이게이즈로 알려진 GW2 단백질의 분자적 특성을 규명한다. gw2 돌연변이체의 표현형 분석을 통하여 GW2 단백질은 종자 길이와 둘레 증가를 억제함을 확인하였다. 또한 전자현미경 분석을 통해서는gw2 돌연변이체에서 알곡이 느슨하게 채워짐을 볼 수 있었다. 효모세포를 이용하여 GW2 단백질 카르복실기 말단부분은 전사 요소로서의 기능을 가지고 있음을 확인하였다. 효모단백질잡종법을 이용하여 GW2 단백질이 세포성장을 위해 세포벽을 느슨하게 만드는EXLA1 단백질과 상호작용함을 확인하였고In vitro pull-down 실험을 통하여 둘의 상호작용을 다시 확증하였다. 시험관내 유비퀴틴화 실험을 통하여 EXLA1 단백질이 유비퀴틴화 되어 26S 단백질 복합체에의해 분해된다는 것이 확인되었다. EXLA1의 전사량은 gw2 돌연변이체에서 증가하였으며, 이는 종자 등숙단계에서 세포분열과 세포 팽창을 활성화 시켰다는 것을 나타낸다. 이 결과들을 종합해 볼 때, GW2 단백질은 종자 크기의 억제인자로 유비퀴틴화를 통한 EXLA1 단백질의 선택적 분해를 유도하며 이는 279번 라이신 잔기에서 일어남을 알 수 있었다. GW2 단백질과 상호작용하는 다른 후보군인 UBC 단백질은E3 라이게이즈로서의 GW2에 특이적으로 결합하는 벼 E2 단백질임을 확인하였다. 그러나 이차원적 전기영동을 통해 gw2 돌연변이체에서 단백질의 양이 증가한 2개의 단백질이 밝혀졌고 이 두 단백질은 GW2와 상호작용은 하지만 유비퀴틴화는 일어나지 않았다. 이 발견들은 GW2 단백질이 PGK와 CHT14의 시스 요소와 결합하여 전사를 촉진한다는 것을 보여준다. 또한 벼 형질전환체 분석을 통하여 GW2 프로모터가 잎, 잎집, 뿌리, 어린화기 그리고 화분에서 주로 발현되는 것을 확인하였다. 결론적으로, 이 결과들은 벼의 종자크기 조절에 유비퀴틴화 통한 단백질 분해복합체 체계가 관여하고 있음을 보여주는 첫 번째 보고이다.