Mis18α에 의한 동원체 크로마틴과 CENP-A 조절에 관한 연구

Abstract

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Mis18α는 염색체의 분리를 조절하는 Mis18 복합체중 하나이다. Mis18 복합체는 세포의 분열기 후반부와 이른 G1기 동안에 동원체에 위치하며, 히스톤 단백질 변이체중 하나인 CENP-A의 동원체 이동을, 단백질 상호간의 결합 없이 조정한다고 알려져 있다. 비록 이러한 Mis18α의 라이선싱이나 프라이밍 기능이 세포 분열기에 동원체의 유지에 중요하지만, 그 메커니즘은 대부분 알려지지 않았다. 이에, 본 연구에서는 Mis18α 유전자의 결손 생쥐를 이용하여 개체 발달과정에 있어서 Mis18α의 생리학적 역할을 조사하고, CENP-A 단백질이 동원체로 침착하는 과정을 조절하는 Mis18α의 메커니즘을 확인하였다. Mis18α 유전자 결손 생쥐는 세포자멸사에 의해 초기 배아 발달과정에서 사멸한다는 사실을 발견하였다. 배아 발달과정중의 3.5일에서 채취한 Mis18α 유전자 결손 배아는 염색체 분리에 심각한 결함을 보이고, 동원체에서 CENP-A가 사라지는 현상을 보인다. 이 배아의 생체 밖 배양실험을 통해, Mis18α 유전자 결손 배아의 경우 내세포집단이 자라지 못하고 세포 사멸에 의해 없어지게 되는 것을 확인하게 되었다. 이러한 배아 발달과정상의 세포자멸사는 Mis18α 유전자 결손에 의해 일어나는, CENP-A 단백질이 동원체에서 사라지는 현상과 염색체의 분리 결함이 누적되어 발생하게 된다는 사실을 알게 되었다. 이 결과를 뒷받침하기 위해서, Cre 유전자의 주입을 통해서 만든 Mis18α 유전자 결손 섬유아세포 (Mis18αΔ/Δ MEFs)를 이용해 CENP-A 이상과 염색체 분열 결함 현상을 조사하였다. Mis18α 유전자 결손 배아에서와 마찬가지로, Mis18αΔ/Δ MEFs 세포는 분열기에서의 결함과, CENP-A의 동원체 이동 이상, 그리고 세포자멸사를 보였다. 결과적으로 Mis18α 유전자 결손은 세포분열 상황에서 CENP-A가 동원체에서 사라지게 만들고, 이는 결국 염색체의 분리 결함을 일으키게 된다. 이러한 결함은 초기 배아 발달과정에서 세포자멸사를 가져와 개체의 생성이 불가능하게 된다는 사실을 통해 배아 발달과정에서 Mis18α의 역할을 규명하였다. CENP-A 와의 결합 없이, CENP-A가 동원체로 이동하는 것을 조절하는 Mis18α의 라이선싱 역할은 동원체의 후성유전학적 조절을 관장함으로써 일어난다는 사실을 확인하였다. 단백질의 라이신기가 메틸화 되거나 아세틸화 되는 히스톤 단백질의 변형은, Mis18αΔ/Δ MEFs 세포에서 정상보다 줄어들어 있음을 알게 되었다. 또한 동원체에서 발생하게 되는 전사체는 반대로 증가되어 있는 것을 Mis18αΔ/Δ MEFs 세포에서 발견하였다. 이를 바탕으로, 이러한 히스톤 변형의 감소와 동원체에서 비롯된 전사체의 증가를 조절하는 효소들 중에서 Mis18α와 결합할 수 있는 단백질을 찾아본 결과, DNA 메틸화 효소인 DNMT3A/3B가 Mis18α의 LRR 부위에 결합한다는 사실을 확인하게 되었다. 이러한 상호간의 결합을 통해 Mis18α 결손 MEFs 세포에서는 동원체에 위치하는 DNMT3A/3B 가 줄어들어 있는 것을 알게 되었고, 이 현상은 정상 Mis18α 단백질의 주입으로 복원이 되지만 DNMT3A/3B 와 결합하지 못하는 변이 Mis18α 단백질로는 복원되지 않는다는 사실도 확인하였다. 결국, Mis18α와 DNMT3A/3B 단백질은 상호간의 동원체 이동을 강화하는 역할을 작용을 한다는 사실 또한 확인하게 되었다. 다음으로 DNA 메틸화 효소의 변화가 가져오는 차이를 확인하기 위해 bisulfite를 이용한 염기서열 분석법을 수행하였다. 이를 통해, Mis18α 유전자 결손이 DNMT3A/3B 단백질의 동원체 이동을 줄여서 동원체 DNA의 메틸화를 정상보다 낮추게 된다는 사실을 밝혔다. 그러므로 Mis18α의 라이선싱 기능은 DNMT3A/3B 와의 결합으로부터 형성되고, 동원체 DNA의 메틸화를 유지하는 역할을 수행해 CENP-A의 동원체 이동을 유지하게 된다. 결론적으로, 세포 분열시에 CENP-A의 동원체로의 이동과 유지는, Mis18α/DNMT3A/3B에 의한 동원체 DNA 부분의 후성유전학적 메틸화 조절을 통해서 이루어지게 된다는 사실을 본 연구를 통해 규명하였다. 또한, CENP-A 이동을 관장하는 Mis18α의 이러한 후성유전학적 조절은 결국 Mis18α의 라이선싱 기능이 동원체라는 구조를 특정하고 유지하게 한다는 사실을 실험적으로 확인하였다.

주요어 Mis18α/ DNMT3A/ DNMT3B/ CENP-A/ 동원체/ 세포 분열기/ 염색체 분리/ 히스톤 변형/ DNA 메틸화/ 후성유전학적 조절

ABSTRACT

Mis18α is a component of Mis18 complex which is regulating chromosome segregation. Mis18 complex has been shown to localize to centromere from late mitosis to early G1 phase and mediates centromeric localization of a histone variant called CENP-A without physical interaction between them. Although this licensing or priming function of Mis18α is crucial for maintenance of centromere during cell division, underlying mechanisms are largely unknown. In this study, I investigated the physiological role of Mis18α in developmental stages using Mis18-deficient mouse and the mechanisms of Mis18α regulating CENP-A deposition in centromere. Mis18α-deficient mouse is lethal at early embryonic stages due to apoptotic cell death. Mis18α-deficient embryos at E3.5 showed severe defects of chromosome segregation and loss of CENP-A in centromere. In vitro culture study revealed the growth retardation in the inner cell mass of Mis18α-deficient embryo and subsequent cell death. The accumulation of missegregated chromosomes by loss of CENP-A in Mis18α-deficient embryo was the cause of apoptotic cell death during embryonic development. In addition, Mis18αΔ/Δ MEFs was generated by Cre introduction and CENP-A loading and chromosome segregation were examined. Similar to the defects in Mis18α-deficient embryos, Mis18αΔ/Δ MEFs showed mitotic defects, CENP-A loss in centromere and apoptotic cell death. Taken together, Mis18α-deficiency led the loss of CENP-A during cell division and hence missegregation of chromosome. The licensing role of Mis18α to load CENP-A to centromere without physical interaction supports the idea that CENP-A loading was managed by epigenetic regulation of centromere. Histone modifications, such as methylation or acetylation on lysine residues of histone H3, were reduced and transcripts from centromere region were increased in Mis18αΔ/Δ MEFs. Among enzymes regulating centromeric-histone modification and controlling transcripts from centromere, DNMT3A/3B interacted with Mis18 in leucine rich region (LRR) of Mis18α. The reduced localization of DNMT3A/3B to centromere in Mis18αΔ/Δ MEFs was rescued by Mis18α wildtype but not by Mis18α mutant possessing LRR mutation. Further, Mis18α and DNMT3A/3B mutually reinforced centromeric localization of each other. Bisulfite sequencing revealed that Mis18α-deficiency led to hypomethylation of DNA in centromere by reducing recruitment of DNMT3A/3B. Thus, licensing function of Mis18α was obtained by interacting with DNMT3A/3B to maintain DNA methylation in centromere. Taken together, CENP-A deposition during cell division was mediated through epigenetic regulation of centromeric DNA methylation by Mis18α/DNMT3A/3B complex. Epigenetic regulation of centromere by Mis18α to maintain CENP-A loading supports licensing function of Mis18α to retain centromeric identity.

Key words Mis18α/ DNMT3A/ DNMT3B/ CENP-A/ Centromere/ Mitosis/ Chromosome segregation/ Histone modification/ DNA methylation/ Epigenetic regulation