Functional and structural analyses of the carboxy-terminal domain of the transcription factor BldD in Streptomyces coelicolor A3(2)

Abstract

BldD 단백질은 토양세균인 방선균 내에 존재하는 단백질로 핵산과 결합하는 기능을 가지며, 167개의 아미노산 서열로 구성되어 있다. 방선균 중의 하나인 Streptomyces coelicolor는 외부 환경이나 영양 요소의 이용여부에 따라 포자를 형성한다. 이러한 포자 형성은 우선적으로 기균사 형성의 선행이 필수적이다. 이러한 기균사의 형성에 BldD 단백질의 역할이 상당히 중요하다는 많은 보고가 있어 왔고, 실제로 이 BldD 단백질은 분화와 관련된 bldN 이나 whiG 과 같은 유전자들을 세포 생장 초기에 억제하는 것으로 밝혀졌다. BldD 단백질은 두 개의 독립된 기능체로 이루어져 있으며, 그 중 아미노 말단에 가까이 위치하는 기능체는 BldD 단백질이 핵산과 결합함에 있어 주된 역할을 하는 것이 본 실험실의 연구를 통해 밝혀졌다. 하지만, 카르복시 말단에 가까이 위치하는 기능체는 BldD 단백질이 기능하는데 있어 어떠한 역할을 하고 있는지에 관한 연구 결과는 현재까지 없는 실정이다. 또한 본 실험실의 연구에 의해 BldD 단백질의 이량체 형성에도 아미노 말단 지역의 기능체가 작용하는 것으로 밝혀졌다. 여러 가지 생리학적 또는 생화학적 방법론을 통해 BldD 단백질의 카르복시 말단 지역 기능체에 대한 다양한 연구가 본 실험실에서 시도되었으나 그 기능을 정확히 동정할 수 없었다. 따라서, 현재까지 시도되었던 생화학적 방법론이 아닌 생물물리학적 접근이 필요한 것으로 생각되었고, 그 중 용액 상태에서의 단백질의 삼차 구조 연구가 가능한 자기공명장치를 이용하여 BldD 단백질의 카르복실 말단 지역 기능체의 삼차 구조를 밝혀내었다. 놀랍게도 그 삼차 구조는 기존에 밝혀졌던 단백질의 구조와는 상이한 새로운 구조인 것으로 밝혀졌으며, 예상과 달리 핵산과 결합할 수 있는 다른 단백질과 높지는 않으나 상당한 정도의 유사성을 보였다. 하지만, 구조적인 유사성과 달리 BldD 단백질의 카르복시 말단 지역 기능체는 일반적인 핵산 결합 단백질과 대조적으로 음전하의 표면을 가지고 있으며, 이 음전하의 분포로 인해 인산에 의해 강한 음전하를 가지는 핵산과 결합할 수 있는 가능성은 매우 적은 것으로 여겨지며, 이것은 젤 이동성 변이 실험을 통해 확인할 수 있었다. 또한 이 단백질은 잘 보존되었고, 외부로 노출되어있는 소수성 아미노산 집합체를 가지고 있는 것이 구조를 통해 분석되었고, 이러한 소수성 아미노산 집합체의 존재로 볼 때 BldD 단백질의 카르복시 말단 지역 기능체는 다른 단백질과의 상호작용을 통해 BldD 단백질의 전체 기능을 조절하는 것으로 예상된다.

BldD is a DNA-binding protein with 167 amino acids and acts as a repressor for key developmental genes in Streptomyces coelicolor. Although extensive researches have emphasized the importance of BldD in developmental processes of Streptomyces, distinct regulatory mechanism of BldD has not been well understood yet. The N-terminal domain of BldD (residues 1-79, BldD-NTD) has clear functions that mediate DNA-binding and dimerization, but the function has not been defined for the C-terminal domain of BldD (residues 80-167, BldD-CTD). Therefore, the function of BldD-CTD could more likely be related with the regulatory mechanism of BldD. In this study, backbone and side-chain NMR assignments of the recombinant BldD-CTD protein could be achieved by a series of NMR experiments on a [13C, 15N]-enriched protein sample. The secondary structure prediction by CSI and TALOS+ analysis using the assigned chemical shift data identified that the BldD-CTD adopts a  fold. From backbone and side-chain assignments of the recombinant BldD-CTD, NOE cross-peaks assignments were also completed for 3D-structure calculation. The determined solution structure of BldD-CTD is very similar to winged-helix domains in spite of different topology. But, DNA-binding of BldD-CTD is not structurally favorable because of slightly negative-charged surface and additional helical region. As removal of additional helical region did not show any functional difference to native protein, assessed by gel mobility shift assays and in vivo complementation experiments, it is the anionic property of the BldD-CTD that appears to be mainly responsible for its inability to bind DNA. Conserved surface analysis of BldD-CTD revealed that highly conserved hydrophobic patch surrounded by charged residues is located opposite to helix-turn-helix region. These structural features suggest that BldD-CTD constitutes a novel fold of winged-helix domain involved in protein-protein interaction and this interaction could be directly related to the regulatory mechanism of BldD.