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Studies on the effect of glucose fluctuation on GLP-1R signaling and anti-diabetic effect of drugs activating GLP-1R in pancreatic beta cells
혈당변동이 췌장 베타세포의 GLP-1R 신호전달에 미치는 영향과 GLP-1R를 활성화시키는 약물의 항당뇨효과에 대한 연구

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Authors
정예황
Advisor
강봉균
Major
자연과학대학 생명과학부
Issue Date
2014-08
Publisher
서울대학교 대학원
Keywords
type 2 diabetesglucose fluctuationGLP-1RER stressexenatidecompound 2compound BDPP 4 inhibitorDA-1229제 2형 당뇨병 당뇨병혈당변동
Description
학위논문 (박사)-- 서울대학교 대학원 : 생명과학부, 2014. 8. 강봉균.
Abstract
당뇨병은 전세계를 위협하는 질환중 하나이다. 가장 일반적인 당뇨병의 유형으로는 제1형 당뇨병과 제2형 당뇨병이 있으며 전체 당뇨병중 90-95%를 제2형 당뇨병이 차지한다. 지속적인 혈당변동현상은 당뇨병 환자에게서 자주 관찰되는 현상이다. 일반적으로 제2형 당뇨병 환자에게서 혈당변동현상은 크게 중요하게 여겨지지 않았다. 하지만, 최근 연구에서 지속적인 고혈당보다 혈당변동이 베타세포의 기능을 좀더 악화시키고 당뇨병성 심혈관 합병증 발병을 증가시킴이 보고된 바 있어 평균 혈당만큼 그 중요성이 부각되고 있다. Glucagon like peptide-1 receptor (GLP-1R) 신호전달은 식후 인슐린 분비의 60%를 차지하는 등 매우 중요한 역할을 담당한다. 하지만 아직까지 혈당 변동현상이 GLP-1R 신호전달에 미치는 영향은 연구된 바가 없다.
이 연구에서는 지속적인 고혈당 현상에서 보다 혈당변동 현상이 베타세포에서 GLP-1을 매개한 분자신호 전달에 좀 더 안좋은 영향을 미칠 수 있음을 가설로 정하였다. 이 가설을 검증하기 위해 INS-1 세포주에 혈당변동을 모방할 수 있는 intermittent high glucose (IHG)와 지속적인 고혈당을 대표할 수 있는 sustained high glucose (SHG)를 72시간동안 처리하였다. 실제 INS-1 세포주에 IHG를 처리 하였을때, SHG를 처리 하였을때에 보다 인슐린 분비가 더 많이 감소되어 있음을 알 수 있었다. 같은 세포주에 IHG를 처리하였을때, SHG 조건에서 보다 ER stress와 세포사멸 분자적 변화가 더 많이 유도되었다. 그리고 흥미롭게도 GLP-1R의 발현도 역시 더많이 감소하였다. 이 결과로 혈당변동 현상이 ER stress의 증가와 GLP-1R의 발현을 감소시키고 그로 인해 더많은 GLP-1R 신호전달에 안 좋은 영향을 미쳤음을 확인하였다. 이 결과는 또한, 실제제2형당뇨병환자에게서혈당조절의중요성을설명해주고있다.
다음으로, GLP-1R agonists인 exenatide가 실제 식후 혈당증가를 억제하고 베타세포사멸을 억제하는 역할이 있는지를 직접 평가하고자 하였다. INS-1 세포주에 exenatide를 처리했을 때 고농도의 글루코스에 의한 세포사멸, 그리고 혈당변동으로 더 많이 유도된다고 알려진 oxidative stress, ER stress로 인한 세포사멸이 억제되었다. 또한 동물실험에서, exenatide가 저혈당을 유발하지 않으면서 식후 혈당증가를 효과적으로 낮추었다. 이 결과로, GLP-1R agonists가 혈당변동을 낮추면서 혈당변동으로 유도될 수 있는 ER stress 와oxidative stress를 억제할 수 있는 좋은 치료제가 될 수 있음을 확인하였다.
비록 exenatide가 좋은 당뇨치료제로의 특성을 가지고 있지만 하루에 두 번씩 피하주사 로투여해야하는 번거로움이 있기 때문에 GLP-1R를 활성화 시킬 수 있는 다른 방법에 대한 연구가 활발하게 진행중이다. 이제까지 경구투여가 가능한 GLP-1R agonist 개발은 성공하지 못했으나 최근 세계적인 제약회사에서 작은 분자량으로 경구투여가 가능한, compound 2와 compound B라고 명명한 GLP-1R agonist를 보고하여 작은 분자량의 GLP-1R agonist 개발가능성을 제시하였다. 이 두 물질은 상이한 분자구조를 가지고 있기 때문에 서로 다른 방법으로 GLP-1R를 활성화시킬 가능성이 있으나 실제 두 물질의 작용기전에 대해서는 직접적으로 비교된 바가 없다. 이에 이 두 물질의 서로 다른 작용기전에 대한 가능성을 검증하기 위해 먼저 GLP-1R가 과발현된 CHO 세포주에 compound 2와 compound B를 잘 알려진 펩타이드 agonists와 antagonists와 같이 처리하여 그 반응을 평가하였다. 평가결과 3종류의 반응에서 두 물질이 서로 다른 활성을 나타냄을 확인하였다. 먼저, compound 2는 내인성 또는 외인성 agonists의 반응을 증가시키지만 최대 반응성은 증가시키지 않았다. 하지만, compound B는 최대 반응성도 같이 증가시켰다. 두번째로, compound 2는 antagonists의 활성을 오히려 증가시켰으나, compound B는 antagonists와같이 처리했을 때 아무런 활성변화도 관찰되지 않았다. 마지막으로, compound 2는 칼슘 흡수를 지속적으로 증가시킨 반면 compound B는 그렇지 않았다. 그리고 흥미롭게도 compound 2와 compound B를 같이 처리했을 때에 가산적으로 반응이 증가되었고 이 결과들로 두 물질이 GLP-1R의 서로 다른 곳에 결합할 가능성이 있음을 설명해주고 있다. 이 실험 결과들을 토대로, 비록 두 개의 agonists가 유사한 GLP-1R 활성화능을 가지고 있지만 서로 다른 곳에 결합해서 서로 다른 작용기전을 나타낼 수 있음을 알 수 있었다. 이 결과들은 또한 아직 구조가 밝혀지지 않은 GLP-1R의 구조를 이해하고 추후 GLP-1R agonist를 개발하는데 큰 도움을 줄 수 있다고 생각된다.
마지막으로 새로운 DPP-4 억제제인 DA-1229의 항당뇨 효과를 평가하는 실험을 진행하였다. 평가결과 세포외 실험에서 DA-1229는 우수한 선택성과 활성을 나타냈다. 동물실험에서는 DA-1229가 혈중GLP-1과 인슐린 분비를 증가시키고 실제 식후 혈당증가를 충분히 낮췄다. 추가적으로, 당뇨병태 모델인 HF-DIO 설치류 모델에서의 인슐린 민감도를 증가시키고 또한 db/db 동물모델에서 당뇨발생을 늦춤을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로 경구투여가 가능하면서 간접적으로 GLP-1R를 활성시키는 DPP 4 억제제인 DA-1229가 실제 제2형 당뇨 치료제의 가능성이 있음을 확인하였다. 이전 임상결과로, DA-1229는 임상시험에 진행할 수 있었고 현재 임상 3상 시험 중 이다.
Diabetes mellitus is one of the most challenging and threatening worldwide health problems. The two most common forms of diabetes mellitus are type 1 and type 2 diabetes (T2DM) and about 90-95% of total diabetes cases have T2DM. Repeated fluctuations in plasma glucose are frequently observed in diabetic patients. Generally, fluctuations in glucose levels in T2DM patients were regarded as less important
however, recent studies have showed that glucose fluctuations are as important as average blood glucose levels, because glucose fluctuations aggravate β-cells function and increase the risk of diabetic cardiovascular complications more profoundly than sustained high glucose. Glucagon like peptide-1 receptor (GLP-1R) signaling in β-cells is a key molecular pathway, accounting for 60% of postprandial insulin secretion. However, GLP-1R signaling under glucose fluctuation conditions has not been determined.
In this study, it was hypothesized that glucose fluctuation conditions had more adverse effects on GLP-1-mediated cellular signaling in β-cells than sustained high glucose (SHG). To evaluate this hypothesis, I induced intermittent high glucose (IHG) conditions, mimicking glucose fluctuations, and SHG conditions in INS-1 cells, rat pancreatic β-cells. When INS-1 cells were exposed to IHG conditions, indeed, GLP-1R-mediated signaling, as evidenced by insulin secretion and calcium influx in β-cells, was reduced more severely than in SHG conditions. In IHG-treated INS-1 cells, ER-stress signaling was significantly higher than in SHG-treated cells, and GLP 1R expression was lower under IHG conditions than under SHG conditions. Taken together, these data suggest that glucose fluctuation induce more severe impairment in GLP 1R signaling, via an increase in ER stress and a reduction in GLP-1R expression, and indicates the importance of tight regulation of blood glucose levels in T2DM patients.
Next, I investigated the postprandial glucose lowering and β-cells protective effect of exenatide, a GLP-1R agonist. When INS-1 cells were treated with exenatide, this agonist prevented β-cell death induced by high glucose, oxidative stress, and ER stress, which were induced more severely under glucose fluctuation conditions than SHG conditions. Additionally, after an oral glucose challenge in C57BL/6 mice, exenatide reduced blood glucose excursions effectively, without inducing hypoglycemia. Collectively, these data show that GLP-1R agonists can be efficacious in treating T2DM, reducing glucose fluctuation and β-cell damage.
Although exenatide has major effects on postprandial glucose lowering and β-cell survival, because of the inconvenience of subcutaneous injection twice per day, other approaches to activate GLP-1R (especially orally active GLP-1R agonists and DPP 4 inhibitors) have been sought. Historically, the discovery of orally active GLP-1R agonists has been unsuccessful, although recently, two large pharmaceutical companies have reported separately two small GLP-1R agonists, compounds 2 and B, showing the possibility of developing orally active GLP-1R agonists. Furthermore, because these two compounds have very different chemical structures, it is possible that they activate GLP-1R in different ways. However, there has been no report yet comparing the mechanisms of action between these compounds. To examine the possibly different mechanisms of action, first, compound 2 or compound B were co-treated with known peptide agonists or antagonists and calcium influx was measured in CHO cells overexpressing GLP-1R. According to these data, I found three mechanisms of action between the two compounds: 1) compound 2 increased the responses to endogenous or exogenous peptide agonists, with no change in maximum efficacy. However, compound B increased both the responses and maximum efficacy. 2) Peptide antagonists augmented the response of compound 2, but did not alter compound B activity. 3) Compound 2 increased calcium influx consistently, while compound B did not. Intriguingly, when compound 2 and compound B were both added to CHO cells expressing hGLP-1R, compound B increased the activation responses of compound 2 additively, indicating that the compounds likely bind to different GLP-1R sites. Together, these results suggest that although two small-molecule agonists have been found to have agonist activity at GLP-1R, compounds 2 and B have different modes of action in activating GLP-1R, with different binding sites on GLP-1R. These results may also offer insight in understanding the as-yet unknown GLP-1R structure and in designing and discovering further novel orally active GLP-1R agonists.
Next, I characterized the mode of action and anti-diabetic effects of DA-1229, a novel DPP 4 inhibitor. DA-1229 was shown to be a potent and selective DPP-4 inhibitor in in vitro assays. After an oral glucose challenge in normal mice, DA-1229 increased GLP-1 and insulin levels, reducing blood glucose excursions. Additionally, DA-1229 improved insulin sensitivity in HF-DIO mice and delayed the onset of diabetes in young db/db mice. Collectively, these results suggest that DA-1229, novel DPP-4 inhibitor activating GLP-1R indirectly, may be a useful substitute for exenatide and a new pharmacological choice for preventing and treating T2DM.
Language
English
URI
https://hdl.handle.net/10371/121396
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Appears in Collections:
College of Natural Sciences (자연과학대학)Dept. of Biological Sciences (생명과학부)Theses (Ph.D. / Sc.D._생명과학부)
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