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Regulatory effect of Rpd31 and Rpd32 on Ssn6 in Candida albicans
Candida albicans의 Ssn6에 대한 Rpd31과 Rpd32의 조절 작용

DC Field Value Language
dc.contributor.advisor강사욱-
dc.contributor.author이지은-
dc.date.accessioned2017-07-14T00:49:13Z-
dc.date.available2017-07-14T00:49:13Z-
dc.date.issued2015-02-
dc.identifier.other000000025662-
dc.identifier.urihttps://hdl.handle.net/10371/121416-
dc.description학위논문 (박사)-- 서울대학교 대학원 : 생명과학부, 2015. 2. 강사욱.-
dc.description.abstractCandida albicans는 사람에게 빈번하게 칸디다증을 일으키는 병원성 곰팡이로, 이러한 C. albicans의 병원성은 둥근 효모 형태의 세포에서 균사를 형성하는 능력과 밀접한 연관이 있다. C. albicans의 이형성은 혈청, 프롤린, N-아세틸글루코사민 및 여러 탄소 영양원과 같은 다양한 형태로 이루어진 외부 환경에 대한 반응으로 일어난다. 외부 환경에 의한 신호는 단순하게 C. albicans의 형태 변화로 이어지는 것이 아니라, 다양하고 복잡한 신호 전달 경로에 의해 이루어진다.
Ssn6는 효모인 Saccharomyce cerivisiae에서 잘 알려진 전사 억제체로, Ssn6의 TPR 모티프를 통해 또 다른 전사 억제체인 Tup1과 결합체 형태로 존재하는 것으로 알려져 있다. 또한, Ssn6는 주로 Tup1과의 결합체 형태로 세포 내 영양 이용, 삼투압에 대한 저항, 감수 분열, 교미, 포자 형성 등 효모 내에서 다양한 세포 작용을 조절하는 것으로 알려져 있다. 이러한 Ssn6는 C. albicans 내에도 존재하며, 효모에서와 같이 Tup1과 결합체 형태로 존재하는 것으로 알려져 있다. 하지만, 본 연구진에서 이루어진 선행 연구들은 Ssn6가 Tup1과는 독립적으로 기능하여 균사 형성 능력 및 병원성을 조절함을 보여주었다.
대부분의 연구들이 S. cerevisiae에서의 Ssn6-Tup1 결합체의 기능과 C. albicans에서의 Tup1 자체의 기능에 초점이 맞추어져 있으나, C. albicans 내에서 Ssn6가 Tup1과 독립적으로 균사 형성과 병원성을 어떻게 조절하는가에 대한 연구는 거의 이루어지지 않고 있다. 따라서, 본 연구에서는 Tandem affinity purification 방법의 도입을 통해 C. albicans 내에서 Ssn6와 결합체로 존재하는 단백질을 분리하고자 하였고, 결과적으로 histone deacetylase인 Rpd31을 동정할 수 있었다.
본 연구를 통해 Rpd31은 Tup1이 없는 세포에서도 Sssn6와 결합할 수 있음을 밝혔고, 또한 Rpd31 자체만으로도 C. albicans의 균사 형성이나 병원성 조절에 상당히 중요한 역할을 하고 있음을 밝혔다. 또한, Ssn6와 Rpd31 모두가 존재하지 않는 균주를 제작하여, 그것을 이용한 실험 결과, 균사 형성과 초기 신장 과정은 Ssn6-Rpd31의 결합체 중 주로 Ssn6에 의해 억제되고 있으나, 균사의 확장적 신장을 활성화하기 위해서는 Ssn6와 Rpd31 모두가 필요함을 밝혀내었다. 이러한 조절 과정에 있어 C. albicans의 균사가 확장적으로 신장에 관여하는 Ume6가 관련되어 있는 것이 밝혀졌다. 크로마틴 항체 침전법을 이용해 Ssn6와 Rpd31가 균사의 확장적 신장과 연관된 UME6 유전자와 대사 관련 유전자인 INO1 유전자에서 서로 다른 유형으로 해당 유전자와 상호작용하는 것을 밝혔고, 특히 이러한 차이가 주로 Rpd31에 의한 것임을 밝혔다. 따라서, Ssn6는 전사 억제체나 전사 활성체 모두로 기능할 수 있으며, 이러한 기능을 결정하는 것이 Rpd31과 목적 유전자와의 상호작용에 의한 것임을 밝혀 내었다.
더 나아가, Rpd31과 상당히 유사한 아미노산 서열을 갖는 Rpd32에 대한 연구를 수행하였다. Rpd31은 Ssn6로 대표되는 결합체에, Rpd32는 Sin3로 대표되는 결합체에 결합하여, 서로 다른 결합체에서 기능하나 목적 유전자나 세포 내 환경에 따라 경쟁적으로 혹은 협력적으로 같은 유전자의 활성을 조절하는 기작을 밝혀 내었다. 또한, 이러한 조절 과정에서 Rpd31이나 Rpd32의 역할에 따라 Sds3가 기능적으로 상이하게 Rpd31, Rpd32와 결합되어 있음 역시 밝혀 내었다. INO1 유전자의 발현 억제와 같이 Rpd31, Rpd32가 모두 전사 억제체로 기능할 때, Sds3는 두 histone deacetylase 모두와 기능적으로 결합되어 있는 반면, UME6 유전자의 전사 조절과 같이 Rpd31이 전사 활성체로, Rpd32가 전사 억제체로 기능할 때는 Sds3는 Rpd31과만 기능적으로 결합되어 있음을 이번 연구를 통해 확인할 수 있었다. 이러한 Ssn6-Rpd31, 그리고 Sin3-Rpd32 결합체 형성과 그에 따른 경쟁적 혹은 협력적 유전자 조절은 C. albicans가 다양한 환경에 유연하게 적응하는 병원성 곰팡이로 존재하는데 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다.
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dc.description.abstractCandida albicans is one of the most common opportunistic fungal pathogens in humans. Its pathogenicity is directly linked to its ability to undergo a morphological transition from the yeast-form to filamentous hyphae. This morphological change is induced in response to a variety of environmental signals such as serum, proline, N-acetylglucosamine, and different carbon sources. From signal induction to morphological transition, there are complex networks of signal transduction pathways.
Ssn6 is known as a general transcriptional repressor, which exists as a complex with the transcriptional repressor Tup1 through its TPR motifs and regulates the genes of many cellular processes including nutrient utilization, osmotic stress, meiosis, mating, and sporulation in Saccharomyces cerevisiae. In C. albicans, Ssn6 also functions as a complex with Tup1, which is a distinct repressor for morphogenesis. However, our previous data revealed that Ssn6 is a critical factor for filamentous growth and virulence independently of Tup1.
Despite many studies focusing on the Ssn6-Tup1 complex in S. cerevisiae and Tup1 in C. albicans, there was not much in-depth understanding of how Ssn6 can regulate the morphological transition and virulence of C. albicans in Tup1-independent manner has not been well understood yet. Therefore, the interaction partner of Ssn6 through tandem affinity purification (TAP) was screened and histone deacetylase Rpd31 was identified as a partner interacting with Ssn6 in Tup1-independent manner in this study. The morphological and transcriptional analyses revealed that Rpd31 is one of the critical factors regulating for morphogenesis and virulence as Ssn6 in C. albicans. It was also found that deletion of SSN6 and RPD31 induced the development of elongated filaments, but caused to be defective in filament extension. Surprisingly, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays of Ssn6 and Rpd31 showed different patterns of enrichment at the promoter of metabolic gene INO1 and hyphal extension gene UME6. These results suggest that Ssn6 has dual functions as a repressor and/or an activator depends on its target genes and participation of Rpd31 for regulation, which is the critical point determining the roles of Ssn6.
Furthermore, the paralogue of Rpd31 and Rpd32 were also investigated for the regulation of filament-development in C. albicans. Rather than that assemble in one complex, Rpd31 and Rpd32 are associated into the different complex, respectively to Ssn6 or Sin3. Two different complexes would regulate the same genes competitively or cooperatively depending on intracellular condition or their target genes. Interestingly, Sds3, which homologue is the component of Rpd3L complex in S. cerevisiae, is partially involved in this differential regulation. In the repression of genes such as INO1 cooperatively by Rpd31 and Rpd32, Sds3 was synchronized with the regulatory actions of Rpd31 and Rpd32. However, in the opposite regulation of genes such as UME6 by Rpd31 and Rpd32, Sds3 was associated only with the active regulation by Rpd31 but not with repressive regulation by Rpd32. This complicated regulatory system might contribute the flexible pathogenicity of C. albicans.
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dc.description.tableofcontentsABSTRACT i
CONTENTS iii
List of Tables vii
List of Figures viii
List of Abbreviations xi

I. INTRODUCTION 1
1. Morphogenesis in Candida albicans 2
1.1. Factors involved in morphogenesis of C. albicans 2
1.1.1. Environmental cues inducing hyphal growth 2
1.1.2. Signal transduction pathways 3
1.1.2.1. MAPK cascade 3
1.1.2.2. cAMP-PKA pathway 3
1.1.3. Response to the environmental pH 7
1.1.4. Repressors related to hyphal growth 8
1.1.4.1. TUP1 8
1.1.4.2. SSN6 8
1.1.5. UME6 9
1.2. Factors related to virulence in C. albicans 10
1.2.1. Adhesins 10
1.2.1.1. ALS family 10
1.2.1.2. HWP1 11
1.2.1.3. Integrin-like protein, Int1 11
2. Identification of protein complex using mass spectrometry 12
2.1. Mass identification 12
2.2. Tandem affinity purification 13
3. Histone deacetylase 14
3.1. Histone deacetylases (HDACs) in yeast 14
3.1.1. RPD3 16
3.1.2. SIR2 16
3.1.3. SIN3 17
3.1.4. SDS3 17
3.2. Interaction between HDACs and Ssn6-Tup1 complex in S. cerevisiae 18
3.3. Rpd3 L- and Rpd3 S- complex 18
4. Aims of this study 19

II. MATERIALS AND METHODS 21
1. Strains and culture conditions 22
1.1. C. albicans strains and culture conditions 22
1.2. Bacterial strains and culture conditions 22
2. General genetic manipulation methods 26
2.1. Plasmids used in this study 26
2.2. Polymerase chain reaction (PCR) 26
2.3. Sequencing of cloned vectors 26
2.4. Transformation of C. albicans by LiAc 29
2.5. Southern blot analysis 29
2.6. Northern blot analysis 30
2.7. Western blot analysis 30
2.8. Real-time RT-PCR 31
3. Tandem Affinity Purification (TAP) 31
3.1. Strategy for Tagging Ssn6p with TAP tag 31
3.1.1. Tagging HPM TAP tag 31
3.1.2. Tagging CPP TAP tag 34
3.2. TAP purification 35
3.2.1. Purification of HPM TAP tag 35
3.2.2. Purification of CPP TAP tag 35
4. MALDI-TOF mass spectrometry and database search 36
5. Gene disruption and overexpression in C. albicans 36
5.1. Disruption of RPD31 in C. albicans 37
5.2. Reintegration of RPD31 in C. albicans 38
5.3. Disruption of SSN6 in rpd31 mutant in C. albicans 38
5.4 Disruption of RPD32 in C. albicans 39
5.5 Disruption of rpd31 rpd32 in C. albicans 39
5.6. Disruption of SDS3 in C. albicans 40
5.7. Overexpression of RPD31 in C. albicans 40
5.8. Overexpression of SSN6 in C. albicans 41
6. Assays used in this study 41
6.1. Assay for the activity of histone deacetylase in C. albicans 41
6.2. Virulence test 42
6.3. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) 42

III. RESULTS 44
1. Identification of Ssn6-interacting proteins through TAP method in C. albicans 45
1.1. Construction a strain of bipartite-TAP tagged in the SSN6 locus 45
1.2. Purification and identification of Ssn6 complex 45
2. Characterization of RPD31 deletion mutant in C. albicans 49
3. Characterization of SSN6 and RPD31 deletion mutant in C. albicans 54
3.1. SSN6 and RPD31 deletion mutant at elevated temperature 54
3.2. SSN6 and RPD31 deletion mutant in filament-inducing conditions 61
4. The requirement of Ssn6 and Rpd31 for the induction of filamentous extension in C. albicans 63
5. Functional relationship between Rpd31 and Rpd32 in C. albicans 68
5.1. Another regulator for filament-development corresponding with
Rpd31 68
5.2. Phenotypic aspects of RPD31 and RPD32 deletion mutants 76
5.3. Identification of proteins interacting with Rpd32 82
5.4. Characterization of SDS3 deletion mutant in relation to Rpd31 and Rpd32 86
5.5. The regulation of metabolic gene INO1 in relation to Rpd31 and
Rpd32 87

IV. DISCUSSION 94
V. REFERENCES 104
국문초록 121
감사의 글 124
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dc.formatapplication/pdf-
dc.format.extent5211784 bytes-
dc.format.mediumapplication/pdf-
dc.language.isoen-
dc.publisher서울대학교 대학원-
dc.subjectTandem affinity purification-
dc.subjectSSN6-
dc.subjectRPD31-
dc.subjectRPD32-
dc.subjectCandida albicans-
dc.subject.ddc570-
dc.titleRegulatory effect of Rpd31 and Rpd32 on Ssn6 in Candida albicans-
dc.title.alternativeCandida albicans의 Ssn6에 대한 Rpd31과 Rpd32의 조절 작용-
dc.typeThesis-
dc.contributor.AlternativeAuthorJi-Eun Lee-
dc.description.degreeDoctor-
dc.citation.pagesxi, 125-
dc.contributor.affiliation자연과학대학 생명과학부-
dc.date.awarded2015-02-
Appears in Collections:
College of Natural Sciences (자연과학대학)Dept. of Biological Sciences (생명과학부)Theses (Ph.D. / Sc.D._생명과학부)
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