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Structural and functional characteristics of ABP34 in Dictyostelium discoideum
Dictyostelium discoideum의 ABP34의 구조와 기능

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Authors
김지혜
Advisor
강사욱
Major
자연과학대학 생명과학부
Issue Date
2015-08
Publisher
서울대학교 대학원
Keywords
Dictyostelium discoideumABP34actin bundling proteinRNAiX-ray crystal structureEF-hand
Description
학위논문 (박사)-- 서울대학교 대학원 : 생명과학부, 2015. 8. 강사욱.
Abstract
Dictyostelium discoideum의 34 kDa 액틴 결합 단백질인 ABP34는 칼슘에 의해 조절되는 액틴 결합 단백질 중에 하나로 낮은 농도의 칼슘이온에서 액틴 미세섬유를 다발로 형성하는데 관여한다. Dictyostelium amoeba에서 ABP34 단백질은 주로 filopodia에서 액틴 미세섬유의 다발을 형성 하는데 역할을 한다. D. discoideum 에서 이 액틴 다발형성 단백질의 세포 내 기능을 알아 보기 위해 RNA 저해 (ABP34 RNAi) 균주를 제작 하였다. ABP34 RNAi 균주는 느리게 성장하였고 세포 크기도 감소되어 있음을 확인하였다. 분화 과정 동안에는 분화 속도가 빠르게 진행 되었고 결실체의 크기 또한 작아져 있었다. 어두운 상태에서 분화를 하였을 때에도 짧은 slug 기간을 보였고 결실체를 빠르게 형성하였다. ABP34를 형광현미경으로 관찰한 결과 세포 성장과 분화 과정 동안 액틴 세포골격에 결합 되어 있음을 알 수 있었다.
ABP34의 특성을 이해하기 위해 Escherichia coli에서 재조합 단백질을 대량 발현하여 분리하였고 결정화 하였다. Gel filtration 크로마토그래피로 ABP34가 용액 상태에서 단일체의 구조로 존재하는 것을 확인하였고 분자량은 32,836 Da 으로 측정되었다. X-선 회절을 이용하여 칼슘 이온이 결합 되어있는 1.89 Å 해상도의 결정 구조를 밝혔고 또한 이 단백질이 액틴 미세섬유와 결합하여 액틴 다발을 형성하는 활성을 가지는 것을 확인하였다. 처음으로 밝혀진 ABP34의 구조는 전체적으로 두 domain의 구조로 칼슘이 결합하는 N-domain과 액틴 결합에 관여하는 C-domain으로 이루어져 있었다. N-domain의 EF-hand는 전하를 띄는 아미노산 잔기에 칼슘이 결합되어 있다. C-domain의 세개의 나선은 다발 모양으로 몇개의 밝혀진 세포골격을 구성하는 단백질들의 일부와 닮은 구조임을 알 수 있었다. 이 C-domain 중에 가장 강한 액틴 결합부위(193-254)의 일부인 216-244 아미노산 잔기는 액틴 결합 단백질인 α-actinin 과 ABP120의 액틴 결합부위와 함께 보존된 서열을 가지고 있다. ABP34의 C-domain의 구조를 통해서 소수성 아미노산과 양전하를 띄는 아미노산으로 이루어진 액틴 결합부위에 해당하는 부분이 표면에 노출되어 있음을 알 수 있었다. C-domain의 보존된 216-244 아미노산 잔기는 액틴의 subdomain 1 과 subdomain 2 사이에 소수성 상호작용을 통해 액틴의 측면에 결합할 것임을 F-액틴과 모델을 통해서 가능성을 제시 하였다. 따라서 C-domain의 구조는 액틴 결합에 중요한 구조라고 생각된다. 또한 ABP34에 칼슘이 결합되어있는 EF-hand와 F-액틴의 결합부위가 있는 C-domain이 두 domain 사이에 상호 작용을 통해 액틴에 결합할 것을 예측 하였다. 따라서 이 ABP34의 구조는 세포골격 단백질 구조 중에서 새로운 형태임을 밝혔고 이것은 액틴 결합을 통해 다발형성을 연구하는데 있어 가치있는 구조적 관점을 제공할 것이다. 또한 이 연구를 통해 Dictyostelium 액틴 다발형성 단백질 ABP34가 성장과 분화 과정 동안 액틴 미세섬유와 결합하여 기능을 하고 특히 slug의 이동에서부터 결실체를 형성하기까지 액틴 다발형성을 통해 세포골격 형성에 중요한 역할을 할것으로 생각된다.

주요어: ABP34, 액틴 다발형성 단백질, X-ray 결정 구조, EF-hand, RNAi, Dictyostelium discoideum
ABP34, 34 kDa actin binding protein of Dictyostelium discoideum is one of the calcium regulated actin binding protein that crosslinks actin filaments into bundles in the presence of low concentration of calcium. The ABP34 protein contributes to formation of actin filament bundles in filopodia of Dictyostelium amoebas. To investigate the biological roles of F-actin bundling protein in D. discoideum, mutant strains that underexpress ABP34 were generated by RNA interference mutant (RNAi). The ABP34 RNAi cells grew more slowly in axenic medium and showed decrease cell size. During developmental, they showed fast rate culmination and final fruiting body was also small size. ABP34 was also shown by fluorescence microscopy to associate with the actin cytoskeleton of cells during growth and development. Under dark condition, they showed short period slugger migration stage and fast formed fruiting body.
To identify actin binding proteins from D. discoideum, ABP34 recombinant protein was overexpressed in Escherichia coli and purified and crystallized. Gel filtration of ABP34 protein indicates monomeric structure of the native protein and molecular weight of ABP34 was estimated to be 32,836 Da. The crystal structure of the ABP34 from D. discoideum was solved by Ca2+/S-SAD phasing and refined at 1.89 A resolutions. F-actin binding and bundling activities are confirmed by co-sedimentation assay and transmission electron microscopy. The electron microscopy data provides direct evidence for binding activity to F-actin. The overall structure of ABP34 adopts a two-domain structure with EF-hand containing N-domain and actin-binding C-domain. The EF-hand is occupied by calcium ion with pentagonal bipyramidal coordination likely with the canonical EF-hand. C-domain structure resembles three-helical bundle which is well superposed into the rod-shaped helical structures of several cytoskeletal proteins. The residues 216?244 in C-domain is a part of the most strong actin binding sites (193?254) and has conserved sequences with the actin binding region of α-actinin and ABP120. The crystal structure of the C-terminal helix reveals a conserved surface exposed hydrophobic residues surrounded by positive charged group that is correspond to actin binding surface. Thus, C-terminal structure is supposed to be crucial for its actin binding. F-actin binding model suggests that ABP34 binds to the side of actin and the residues 216?244 fit into a pocket between actin subdomains 1 and subdomain 2 by hydrophobic interactions. These studies provide insights into the calcium coordination in the EF-hand and F-actin binding site in C-domain of ABP34 which are associated through inter-domain interactions. The structure of ABP34 is a novel type of actin bundling protein in cytoskeletal protein structures, which could provide valuable structural insights into the efficient actin bundling of actin binding domain. These results suggerst that Dictyostelium actin bundling protein ABP34 may be important for growth and developmental process, especially migrating slug to fruiting body by regulating actin cytoskeleton.


Key words: Dictyostelium discoideum, ABP34, actin bundling protein, RNAi, X-ray crystal structure, EF-hand
Language
English
URI
https://hdl.handle.net/10371/121430
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Appears in Collections:
College of Natural Sciences (자연과학대학)Dept. of Biological Sciences (생명과학부)Theses (Ph.D. / Sc.D._생명과학부)
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