Rev-erbα 조절물질 발굴과 도파민 보상 회로에서의 일주기 기능에 관한 연구

Abstract

인간을 포함한 대부분의 생명체는 조직 및 세포 수준에서 약 24 시간 주기성의 생리학적이고 행동학적인 체내 생체 시계 시스템을 유지하고 있다. 생체 시계 시스템은 뇌의 시신경교차상핵 (suprachiasmatic nucleus

SCN)에 위치하는 중추시계와 국부 및 말초 시계에 의해 계층적인 구조로 구성되어 있다. 이 시스템은 Bmal1, Clock, Per1/2/3, Cry1/2, Rev-erbα, Rorα와 같은 일련의 생체시계 조절 유전자들로 구성되어 있다. 최근의 다양한 연구 결과들은 생체 시계를 구성하고 있는 유전자들이 본연의 역할 뿐만 아니라 각종 신진대사 및 행동학적 수준에서의 현상들에 큰 영향을 미치고 있음을 보고하고 있다. 특히 최근 Rev-erbα 유전자가 가지는 다형성에 대한 연구가 활발히 진행되고 있고, 정신분열증, 조울증, 두려움을 포함하는 각종 정서질환과 다양한 대사성 질환 측면에서 Rev-erbα의 필수적인 역할이 대두되고 있다. 연구 결과에 의하면 Rev-erbα는 도파민 생합성을 촉진하는 Nurr1 유전자와 경쟁적인 활성을 보이며 전체적인 도파민 수준을 조절한다. 따라서, 합성된 특이 화합물을 사용하여 Rev-erbα의 활성을 조절하는 일은 비정상적인 생체시계에 의해 유도된 다양한 신진대사 관련 질환 뿐만 아니라 중독, 정서 질환, 파킨슨 질병 등을 아우르는 도파민 대사 관련 질환 역시 치료 가능함을 제시해 줄 것이다. 제 1장에서는, Rev-erbα 활성 조절이 가능한 신규 화합물을 발굴하고, 이 화합물의 처리에 의해 생체시계 수준에서의 활성이 효과적으로 조절되는지 연구하였다. Rev-erbα가 접합하는 특이 영역인 RORE의 활성을 반영하는 리포터를 제작하고, 이를 사용하여 신약 후보 물질로 구성된 화합물 라이브러리를 대상으로 세포기반 스크리닝을 수행하였다. 이들 중 KK-S6 화합물은 RORE를 매개하는 전사활성을 효과적으로 감소시켰고, 전사 수준 뿐만 아니라 단백질 수준에서 역시 생체시계 중심 분자인 Bmal1을 감소시켰다. 이러한 KK-S6의 활성은 Rev-erbα가 결핍된 세포 내에서 소멸되는 반면 Rev-erbα를 과발현 시킨 세포주에서는 증폭되었다. 이를 통해 KK-S6는 Rev-erbα에 의존적인 활성을 갖는 것으로 추정된다. 이 화합물은 세포 수준에서 뿐만 아니라 조직 수준에서 역시 생체 시계 진폭 변화에 효과적인 활성을 보였다. 더욱이 Rev-erbα 하위 수준의 여러 유전자들은 KK-S6의 처리에 의해 효과적으로 조절되었다. 이러한 결과들은 Rev-erbα 활성 조절 신규 화합물인 KK-S6이 비정상적인 생체시계 관련 질병들을 Rev-erbα 활성을 증폭시킴으로써 효과적으로 조절해 낼 수 있는 치료제로써의 가능성을 제기한다. 제 2장에서는, 과도한 설탕물 탐닉이 유도된 생쥐 모델을 사용하여 도파민 시스템이 관장하는 보상 회로에서의 Rev-erbα 역할을 조사하였다. 반복적으로 설탕물을 탐닉하는 생쥐의 행동학적 양상은 높은 수준의 두려움 및 우울증 관련 행동들의 유발을 촉진하였다. 또한 유전학적 관점에서 중독의 표지 유전자로 간주되는 ΔFos B가 뇌의 특정 영역인 측위 신경핵에서 높은 수준으로 발현하고 있었고 이와 동시에 Nurr1 유전자의 발현 역시 같은 시간대에 급격하게 증가되어 있었다. 이러한 현상은 설탕물 섭취를 중단시킨 후 Rev-erbα 유전자의 발현이 증가하면서 다시금 정상적으로 회복되었으나 TH의 변화를 동반하지는 않았다. 또한 설탕물에 대한 보상은 빛이 없는 조건에서 생쥐의 활성 리듬을 효과적으로 조절하였고, 간 내 지방대사에까지 영향을 미치고 있었다. 상기한 연구결과를 통해 Rev-erbα 는 비정상적인 보상 활동에 의해 뒤바뀐 도파민 대사 및 민감도에 대하여 유발되는 일련의 항상성 유지 활동에 있어서 일종의 버퍼로써 중요한 역할을 하고 있음을 밝히었다.

Circadian rhythms are biological oscillations that occur over a 24 hour period. They are maintained by an innate, genetically determined timekeeping system called the molecular circadian clockwork. Despite the physiological and clinical importance of the circadian clock, small molecule modulators of the core clock machinery remain largely unexplored. Thus I aimed to identify a synthetic molecule that influences the circadian clock molecular feedback loop via REV-ERBα activity. In Chapter 1, I aimed to identify novel small molecules that effectively and specifically modulate REV-ERBα activity and its physiological functions in circadian oscillation. I screened an in-house chemical library using ROR/REV-ERB response elements (RORE)-driven luciferase reporter cell-based assay (CBA). One compound, designated KK-S6, repressed the RORE-dependent transcriptional activity of the mBmal1 promoter and reduced endogenous BMAL1 protein expression. More importantly, KK-S6 significantly altered the circadian oscillation amplitude of Bmal1 and Per2 promoter activities in a dose-dependent manner, but barely affected the period length. In addition, KK-S6 strengthened transcriptional repression by REV-ERBα and effectively decreased mRNA expression of downstream genes of REV-ERBα that contained a RORE cis-element in their promoter. These findings suggest that KK-S6 could potentially be used as a treatment for clock-related disorders by increasing REV-ERBα activity. One of the novel physiological functions of circadian clock components is brain dopamine (DA) metabolism. Specifically, our laboratory previously determined that the circadian nuclear receptor, REV-ERBα, modulates tyrosine hydroxylase (TH) transcription through competition with nuclear receptor 1-related protein (Nurr1), a transcriptional activator of DA biosynthesis genes in the ventral tegmental area (VTA). Although considerable evidence suggests the prominent role of REV-ERBα in DAergic system, it is still unclear whether REV-ERBα can act on dopamine-reward system. Thus I examined the circadian action mediated by REV-ERBα on dopamine-reward system. In Chapter 2, I investigated the impact of REV-ERBα on the dopamine reward system using a sucrose-seeking mouse model. Compulsive sucrose consumption led to abnormal mood-related behaviors, including high anxiety and depression levels throughout the circadian cycle. The FosB splice variant (ΔFosB), a molecular marker of addiction, was induced in the nucleus accumbens (NAc) of sucrose-seeking mice at dusk. Simultaneously, Nurr1 expression was also greatly increased. During a 10-day sucrose withdrawal period, Nurr1 expression returned to baseline levels and Rev-erbα was hyperexpressed

however, TH expression was unaltered. Moreover, sucrose reward managed circadian activity rhythms in the absence of light cue and can affect liver fat metabolism. These findings suggest that compulsive sucrose consumption can lead to abnormal emotional behaviors and gene expression alteration in the brain and liver, which are similar to symptoms experienced by binge-eating disorder (BED) patients. REV-ERBα may act as a controller, maintaining normal DA tone and homeostasis in response to DA transmission alterations following compulsive sucrose consumption. Overall, I successfully identified a novel synthetic molecule modulator of REV-ERBα and revealed the mechanism for REV-ERBαs circadian action on the reward pathway. These findings suggest that disrupted reward system by sucrose overconsumption can be recovered by enhancing the REV-ERBα activity using its modulator.