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Heterogeneity of genetic changes associated with acquired crizotinib resistance in Anaplastic lymphoma kinase-rearranged lung cancer
Anaplastic lymphoma kinase 유전자가 재배열된 폐암에서 crizotnib내성과 연관된 유전적 변화의 이질성(異質性)

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Authors
김소연
Advisor
허대석
Major
의과대학 협동과정 종양생물학전공
Issue Date
2012-08
Publisher
서울대학교 대학원
Keywords
ALKEML4-ALKCrizotinibresistance mutation
Description
학위논문 (박사)-- 서울대학교 대학원 : 협동과정 종양생물학전공, 2012. 8. 허대석.
Abstract
서론: ALK가 재배열된 폐암에서ALK의 tyrosine kinase억제제인 crizotinib이 임상실험에서 뛰어난 효과를 나타내었지만, 이내 crizotinib에 대한 약제 내성을 나타내는 환자가 발생하였다. 약제내성의 원인으로는 ALK가 과발현되어 있거나, tyrosine kinase 부위에 새로이 생긴 돌연변이가 알려져 있다. 본 논문에서는 ALK가 재배열된 폐암환자에서 crizotinib의 약제내성에 관여하는 유전자의 돌연변이에 대해서 확인하고자 한다.
방법: crizotinib에 내성을 보인 7명의 환자의 샘플을 이용해서 ALK의kinase domain에서 나타나는 돌연변이 유무를 RT-PCR과 sequencing 방법을 통해서 확인하였다. 또한, EGFR 과KRAS의 돌연변이 발생 유무도 추가적으로 확인하였다. In vitro 실험으로ALK가 재배열된 EML4-ALK를 가지는 세포주 NCI-H3122와 crizotinib에 내성을 나타낸 환자에서 만든 세포주 SNU-2535를 가지고 crizotinib에 대한 항원항체반응(western blot)과 세포성장 실험등을 진행하였다.
결과: 기존에 보고된 L1196M 또는 G1269A라는 ALK의 이차적인 돌연변이를 7명중에 3명의 환자샘플에서 확인하였고 한 환자의 샘플에서는 두 개의 돌연변이가 함께 발현되고 있음을 확인 할 수 있었다. 반면에 나머지 4명의 환자에서는 ALK kinase domain에서 어떠한 돌연변이도 찾을 수 없었다. 흥미로운 사실은 돌연변이를 찾을 수 없었던 4명의 환자 중 한 명의 환자샘플에서 EGFR-L858R이라는 EGFR의 신호전달을 활성화 시켜주는 돌연변이를 찾을 수 있었고, ALK의 재배열이 여전히 유지 되고 있는 상황에서 이런 기작이 이루어지고 있음을 확인 할 수 있었다. 그래서 이런 L1196M과 G1269A돌연변이를 가지는 세포주를 만들기 위해서 retrovirus를 이용하여 인위적으로 만든 후에, crizotinib에 의한 약제효능에 어떤 영향을 끼치는지 확인해 보았다. 이들 돌연변이는 crizotinib에 의해서 억제되는 ALK의 신호전달과정을 방해하고 있었으며 종양 세포의 성장저해가 억제되고 있음을 확인할 수 있었다. 또한 환자샘플로부터 만들어낸 내성을 지닌 세포주 SNU-2535에서 G1269A가 존재함을 확인하였고, 이세포주에 crizotinib을 주었을 때 세포성장 억제가 저해되고 Akt와 ERK와 같은 ALK 신호전달체들의 발현이 저해되고 있음을 확인 할 수 있었다. 이는 앞서서 찾아낸 돌연변이들이 crizotinib에 내성을 나타내고 있음을 다시금 확인시켜주는 결과이다.
결론: 임상적으로, crizotinib은 ALK가 재배열 된 폐암에서 굉장한 효과를 보이는 약제이지만 내성이 발생되는 문제점을 가지고 있다. 본 논문에서 밝힌 L1196M 과 G1269A 돌연변이는 이런 폐암에서 crizotinib의 내성에 관여하는 것을 확인 할 수 있었다. 하지만 crizotinib에 대한 내성의 원인을 특정 유전자 돌연변이만으로는 모든 환자에서 설명할 수는 없었다. 이런 관찰의 결과들은 이후 환자에서 발생하는 crizotinib의 약제 내성을 극복하는 치료법에 중요한 역할을 할 것이라고 생각된다.
Purpose: Anaplastic lymphoma kinase (ALK)-rearranged lung cancers are markedly responsive to treatment with the ALK tyrosine kinase inhibitor crizotinib. Unfortunately, patients with this type of cancer can acquire resistance to crizotinib through several mechanisms, including ALK amplification and mutations at L1196M and G1269A. In this paper, we evaluated whether a specific gene mutation in ALK triggers resistance to crizotinib in ALK-rearranged lung cancer patients.
Material and Methods: Tumor samples were derived from seven ALK-positive NSCLC patients who showed acquired resistance to crizotinib and these were analyzed for ALK, EGFR, and K-ras mutations. In addition, available tumor tissues before crizotinib were retrieved for these molecular tests. In vitro cytotoxicity and ALK downstream signaling pathways were compared between EML4-ALK-positive (NCI-H3122) and crizotinib-resistant (SNU-2535) cell lines.
Results: The specimens of seven patients had evaluable material for secondary mutations that were reported previously. Three patients had developed either a G1269A or an L1196M mutation in the ALK tyrosine kinase domain, but no identifiable genetic mutation was found in the other four patients. One patient had both the L1196M and G1269A mutations. Interestingly, one patient who did not have any resistance mutation exhibited an EGFR L858R mutation in a post-crizotinib biopsy sample in addition to an ALK gene rearrangement, as determined by FISH analysis. We showed that the L1196M and G1269A mutations inhibited crizotinib-mediated downregulation of ALK signaling and blocked cell growth inhibition in EML4-ALK L1196M- and G1269A-mutated cells. Furthermore, we developed crizotinib-resistant SNU-2535 cells from the pleural effusion of a patient who harbored a G1269A mutation. In addition, we found that crizotinib inhibited cell proliferation, induced apoptosis and inhibited signaling pathways, including Akt and ERK, in a wild-type EML4-ALK-positive cell line but not a crizotinib-resistant cell line.
Conclusions: Clinically, crizotinib is effective against ALK-rearranged lung cancer, but drug resistance is problematic. The current data demonstrate that the L1196M and G1269A mutations of the ALK tyrosine kinase domain are associated with resistance to crizotinib in some of ALK-rearranged lung cancer.
However, a clear genetic mutation causing resistance to crizotinib has not been identified.
Language
English
URI
https://hdl.handle.net/10371/121759
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Appears in Collections:
College of Medicine/School of Medicine (의과대학/대학원)Program in Cancer Biology (협동과정-종양생물학전공)Theses (Ph.D. / Sc.D._협동과정-종양생물학전공)
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