Development of competition ELISA for N-terminal fragment of proBNP (NT-proBNP) using peptide mimotope and bispecific antibody against NT-proBNP and cotinine

Abstract

나트륨이뇨 펩타이드의 N-말단 전구 물질인 NT-proBNP는 울혈성 심부전증을 진단하기 위한 중요한 바이오마커이다. 비록 NT-proBNP의 생물학적 기능은 잘 알려져 있지 않으나, 이것은 바이오마커로서의 많은 이점을 가지고 있다. NT-proBNP는 여러 개의 O-글리코실화 사이트를 가지고 있으며, 혈액 내에 존재하는 NT-proBNP 또한 글리코실화 되어 있다고 알려져 있다. 따라서 글리코실화-비의존적 결합을 하는 항체를 개발하는 것은 매우 어려운 일이다. 게다가 생리학적인 단백질 가수분해에 의해 N- 또는 C-말단 부분이 잘려진 NT-proBNP단편이 관찰되기도 하였다. 재조합 NT-proBNP-Fc 융합 단백질은 혈액 내에 존재하는 NT-proBNP와 마찬가지로 글리코실화 되어 있다. 항-NT-proBNP 단클론 항체인 NPBR9은 토끼 면역 라이브러리로부터 생성되었으며, 이것은 이중특이성 scFv-Cκ 융합 항체 및 IgG1 항체 형태로 개조되었다. 이 항체의 항원에 대한 결합 부위는 무작위적 펩타이드 라이브러리를 이용한 파지 디스플레이 및 위치 선택적 돌연변이 유발 실험을 통해 특징 분석을 하였다. NPBR9 항체의 에피톱은 NT-proBNP의 C-말단 인근에 위치하고 있으나, 단백질 가수분해에 취약한 C-말단의 가장 끝 부분은 아닌 것으로 밝혀졌다. 이 에피톱은 H64R65K66의 3개의 아미노산으로 구성된 공통 서열을 가지고 있다. 또한 우리는 NT-proBNP의 G63 또는 K66 잔기가 치환된 경우, 항체에 대한 반응성이 완전히 사라지는 것을 알게 되었다. 뿐만 아니라, C-말단에 –GGGSC 링커를 연결한 펩타이드 미모톱을 합성하였고, 이것은 경쟁적 효소 면역측정법을 통해 재조합 NT-proBNP-Fc 융합 단백질과 경쟁을 하는 것을 확인하였다. 우리는 이 연구를 통해 글리코실화 및 양쪽 말단의 절단에 거의 영향을 받지 않는 에피톱에 반응하는 항체를 개발하고자 하였다. 다음에는 이 항체와 에피톱을 모방한 펩타이드를 이용하여 경쟁적 효소 면역측정법을 수행하였다. 그리고 샌드위치 효소 면역 측정법을 통해 NPBR9 항체가 글리코실화 된 재조합 NT-proBNP 및 탈당화 된 NT-proBNP 모두에 비슷한 반응성을 가지고 있다는 것을 확인하였다. 그러나 우리가 개발한 경쟁적 효소 면역측정법은 매우 낮은 농도의 NT-proBNP의 민감한 검출을 하기에는 충분하지 않았다. 이미 선행 연구를 통해 NPBR9 항체가 글리코실화 및 양쪽 말단의 절단에 영향을 받지 않는 것을 알았기 때문에, 이 항체를 샌드위치 효소 면역측정법의 검출항체로 적용해 보았다. 상업적으로 이용되는 효소 면역측정법으로는 글리코실화 되었거나 단편으로 존재하는 NT-proBNP의 검출이 어려웠으나, 우리의 항체를 적용했을 경우에는 아마도 이런 한계를 극복할 수 있을 것으로 기대한다. 결과적으로, 우리는 글리코실화-비의존적 결합을 할 수 있는 NT-proBNP의 Gly63–Lys68 부분에 반응하는 항체를 개발하였고, 샌드위치 효소 면역측정법을 통해 NT-proBNP의 글리코실화 여부와 관계없이 항체의 반응성이 있다는 것을 확인하였다. 마지막으로 우리는 이 항체와 펩타이드 미모톱을 이용한 경쟁적 효소 면역측정법을 개발하였다.

N-terminal fragment of proBNP (NT-proBNP) is an important biomarker for diagnosis of congestive heart failure. Although biological function of NT-proBNP is not well known, it has many benefits as a biomarker. NT-proBNP has several O-linked glycosylation sites indicating that circulating NT-proBNP in human blood is also glycosylated. It is quite difficult to develop an antibody that exhibits glycosylation-independent binding. In addition, N- and C-terminally truncated NT-proBNP, cleaved by physiological proteolysis, was identified. The recombinant NT-proBNP-Fc fusion protein was glycosylated like as circulating NT-proBNP in human blood. NPBR9, monoclonal anti-NT-proBNP antibody, was generated from rabbit immune libraries and it was modified to bispecific scFv-Cκ fusion protein and IgG1. Characterization of the binding sites was identified by phage display of a random peptide library and site-directed mutagenesis. Its epitope was located close to C-terminal region of NT-proBNP rather than extreme C-terminus. Furthermore, the epitope of NPBR9 has the consensus sequence containing three amino acids, H64R65K66 in NT-proBNP. We also identified that substitution of G63 or K66 in NT-proBNP completely abolished its reactivity to the antibody. In addition, peptide mimotopes were chemically synthesized with –GGGSC linker at the C-terminal end, and they were competed with the recombinant NT-proBNP-Fc fusion protein in the competition immunoassay. In this study, we aimed to develop an antibody reactive to an epitope that is relatively less influenced by glycosylation and N- and C-terminal cleavage. Then we performed a competition enzyme immunoassay using this antibody and epitope mimetic peptides. And, through sandwich enzyme immunoassay, the reactivity of this antibody to both recombinant and de-glycosylated NT-proBNP were confirmed to be quite similar. However, this competition enzyme immunoassay was not enough to sensitive detection for lower concentration of NT-proBNP. Hence, we applied NPBR9 as detection antibody in sandwich immunoassay, because NPBR9 is less influenced by glycosylation and N- and C-terminal cleavage. Therefore, it may be overcome of inadequate to detection of glycosylated or truncated NT-proBNP. In conclusion, we report that an antibody reactive to Gly63–Lys68 of NT-proBNP exhibits O-glycosylation-independent binding, and its reactivity to NT-proBNP whether glycosylated or not was confirmed by sandwich enzyme immunoassay. Finally, we developed a competition enzyme immunoassay using this antibody and peptide mimotopes.