Identification and Evaluation of Endogenous Markers for the Assessment of CYP3A Activity using Metabolomics

Abstract

Cytochrome P450 (CYP) 3A은 주요 약물대사효소로 그 활성을 예측하는 마커를 발굴하는 것은 임상적 유용성이 크다. 본 연구에서는 대사체학 분석을 통해 CYP3A 활성을 반영하는 마커를 발굴하고자 하였다. 연구는 공개 상태에서 3 가지 치료를 3 기에 걸쳐 정해진 순서에 따라 모두 투여 받는 형태로 설계되었고, 24 명의 건강한 성인 남성이 연구에 참여하였다. 자원자들은 각 시기별로 다음과 같이 midazolam 을 투여 받았다

1기에 midazolam 1 mg, 2기에 ketoconazole 400 mg 을 1일 1회씩 3일 동안 반복 투여 후, ketoconazole 과 midazolam 1 mg 을 1시간 투여 간격을 두고 병용 투여 받았다. 이후에도 3기에 rifampicin 600 mg 을 1일 1회씩 9일 동안 반복투여 후, 10일째에 rifampicin 과 midazolam 2.5 mg 을 병용 투여하였다. 약동학적 평가를 위해 각 투여 시기의 마지막 투여 후 일정 시각에 채혈하여 혈장 중 midazolam, 1-hydroxy midazolam, 4-hydroxy midazolam 의 농도를 측정하였다. 약동학 분석은 비구획모형 및 구획모형을 이용하여 분석하였고, midazolam 단독투여 시의 결과와 ketoconazole 또는 rifampicin 병용투여 시의 결과를 각각 비교하였다. 약물처치에 따른 대사체 및 약동학에 미치는 유전적 영향을 평가하기 위해 CYP3A, NR1I2의 유전형 분석을 시행하였다. 대사체 평가를 위해 midazolam 투여 전 24시간 및 투여 후 24 시간까지 48시간동안 12시간 간격으로 소변을 수집하였고, midazolam 투여 전 혈액샘플을 수집하였다. 스테로이드 프로파일링은 가스 크로마토그래피-질량분석기를 이용하여 분석했다. Untargeted metabolomics 를 통해 CYP3A 활성 억제 시기에 isobutyryl-L-carnitine이 감소하였고, CYP3A 활성 유도 시기에 glycochenodeoxycholate-sulftae가 증가하는 것을 확인하였다. Targeted steroid profiling 을 통해 기존에 알려져 있던 6β-hydroxy-cortisol / cortisol, 6β-hydroxy-cortisone / cortisone, 혈장 4β-hydroxy-cholesterol 이외에 7β-hydroxy dehydroepiandrosteron (DHEA) / DHEA 비율 및 16α-hydroxy DHEA / DHEA 이 midazolam의 청소율과 상관관계가 높은 것을 확인하였다. Midazolam의 청소율과 대사체 분석을 통해 CYP3A 활성을 대변하는 midazolam의 청소율을 반영하는 다음과 같은 식을 도출하였다

Ln(CL) = 2.1539 + 0.2724 * I + 0.0101 * DHEA + 0.0910 * R1 + 0.6502 * R2 (I = 1 if CYP3A5*1/*3, otherwise 0, R1: 7β-hydroxy DHEA / DHEA ratio, R2: 6β-hydroxy cortisone / cortisone). 건강한 자원자에서 ketoconazole 과 rifampicin 의 병용에 의해 내인성 물질이 유의한 변화를 보였고, 이를 통해 CYP3A의 활성을 반영하는 마커를 탐색하였다. 대사체 분석을 통해 CYP3A 의 활성을 예측할 수 있고, CYP 매개 약물대사를 예측할 수 있다.

Cytochrome P450 (CYP) 3A is a major drug-metabolizing enzyme. The activity marker for CYP3A has clinically meaningful. This study identified the endogenous markers for CYP3A activity in healthy subjects. An open-label, 1-sequence, 3-period, 3-treatment, crossover study was conducted in 24 healthy Korean male volunteers. Each subject received a midazolam in each of 3 study periods: midazolam 1 mg alone (control phase)

midazolam 1 mg after pretreatment with 400 mg ketoconazole once daily for 4 days (CYP3A inhibited phase)

and midazolam 2.5 mg after pretreatment with 600 mg rifampicin once daily for 10 days (CYP3A induced phase). Serial samples were collected for pharmacokinetic analysis for midazolam, 1-hydroxy midazolam and 4-hydroxy midazolam. Pharmacokinetic parameters were obtained noncomoopartmental analysis and compartmental analysis. The 12-hours interval urine samples were collected for metabolomics analysis between 24 hours before and 24 hours after of midazolam administration in each study period. Plasma and urine samples were determined using gas chromatography-mass spectrometry and liquid chromatography-mass spectrometry. From the untargeted metabolomics, isobutyryl-L-carnitine decreased in CYP3A inhibition state and glycochenodeoxycholate-sulftae was increased in CYP3A induction state. From the targeted steroid profiling, the known CYP3A activity markers, urine 6β-hydroxy-cortisol / cortisol and 6β-hydroxy-cortisone / cortisone, and plasma 4β-hydroxy-cholesterol, but also 7β-dehydroepiandrosteron (DHEA) / DHEA and 16α-hydroxy-DHEA / DHEA were well correlated with midazolam clearance. From the correlation analysis between midazolam clearance and metabolites changes, the equation for midazolam clearance was obtained

Ln(CL) = 2.1539 + 0.2724 * I + 0.0101 * DHEA + 0.0910 * R1 + 0.6502 * R2 (I = 1 if CYP3A5*1/*3, otherwise 0, R1: 7β-hydroxy DHEA / DHEA ratio, R2: 6β-hydroxy cortisone / cortisone). The current study showed changes of endogenous metabolites after ketoconazole or rifampicin co-treatment in healthy volunteers, and provided the metabolites for CYP3A activity markers. Metabolomic approach could provide predictable markers for CYP3A4 activity and insight about variability in CYP-mediated drug metabolism.