Intracarotid Injection of Adipose Tissue-originated Platelet-Derived Growth Factor Receptor β-positive Cells in Rat and Canine model: Feasibility of Cell Delivery under Mannitol-induced Blood-Brain Barrier Opening

Abstract

지방조직유래 기질세포에서 분리된, 혈소판유래성장인자 베타수용체를 가진 혈관주위세포 (AT-PDGFRβ+세포)는 다가능성 중배엽 줄기세포로서, 이를 이용한 세포기반의 신경재생치료가 기대된다. 본 연구는 만성뇌졸중을 유도한 백서 모델에서 AT-PDGFRβ+세포를 경동맥으로 주입할때, 고장성의 만니톨에 의해 세포전달의 효율성이 증진되는지, 또한 반대측 경동맥으로 주입된 AT-PDGFRβ+세포가 뇌경색 반구에 도달하여 신경원세포 또는 혈관내피세포로 분화하는지 알아보고자 하였다. 또한 정상 개에서 고장성 만니톨과 자가 AT-PDGFRβ+세포의 안전성을 확인하고자 하였다. 백서에서 만성뇌졸중이 유도된 뒤 3주후에, 1.4M 만니톨 (2mL, 0.1mL/sec)과 2x106개의 인간 AT-PDGFRβ+세포를 반대측 경동맥으로 주입하는 만니톨사용군 (n=9)과 2mL 멸균 PBS와 2x106개의 인간 AT-PDGFRβ+세포를 주입하는 대조군 (n=6)으로 구분하였다. 만니톨사용군에서 AT-PDGFRβ+세포는 주입 3일째 비경색 반구와 뇌량에서, 주입 7일째 경색 반구에서 발견되었다. 그러나 만니톨 전처치없이 반대측 경동맥으로 주입한 경우 7일째 뇌경색 부위에서 관찰되는 AT-PDGFRβ+세포는 거의 없었다. 28일째 AT-PDGFRβ+세포는 뇌경색 반구의 혈관주위 공간에 주로 위치하였으며 EBA (~65%), αSMA (~40%) 또는 NF (~20%)로 염색되었다. 정상 개 (25kg, n=6)에서 고장성 만니톨 (20%, 50mL, 1g/kg)과 5x106개의 자가 AT-PDGFRβ+세포를 경동맥을 통해 주입하였다. 첫번째 프로토콜 (n=2)에서, 세포를 2mL의 생리식염수에 혼합하여 1분동안 손으로 주입하였다. 두번째 프로토콜 (n=4)에서, 50mL 생리식염수, 1,000 단위의 헤파린, 세포용액으로 구성된 혼합액을 10분 동안 천천히 점적하였다. 각각의 시술단계에서 평균동맥압, 맥박수, 산소포화도는 변화 없었다. 혈액검사에서 백혈구 개수, 혈색소 수치, 칼슘, 칼륨, 알부민 및 전단백질 수치가 기준치에 비해 시술후 감소하였으나 다른 혈구 개수, 전해질, 간 및 콩팥 지수, 염증지수는 정상 범위였다. 6마리 개 모두에서 신경학적 결손이 없고 연속된 혈관조영에서 동맥의 개방성을 보였으나, 뇌자기공명영상에서 군데군데 여러 개의 (프로토콜 1

2마리 중 한마리) 또는 작고 일시적인 단일 (프로토콜 2

4마리 중 한마리) 병변이 관찰되었다. 개의 뇌절편에서 동측과 반대측 반구 피질 모두에서 AT-PDGFRβ+세포가 발견되었으며, 특히 동측 반구와 전두엽에 좀더 빈번하게 발견되었다. 뇌경색 부위에서도 AT-PDGFRβ+세포가 발견되었으며, 뇌경색 부위 여부에 무관하게 혈관주위공간 (70%), 혈관바깥쪽 (20%), 그리고 혈관안쪽 (10%)에서 관찰되었다. 요약하면, 고장성 만니톨은 백서의 만성뇌졸중 모델에서 혈액-뇌장벽을 일시적으로 열어줌으로써 반대측 경동맥에서 주입된 인간 AT-PDGFRβ+세포가 혈액-뇌장벽 내부로 들어갈수 있게 하며, 뇌량을 건너 허혈반구로 이주하고 신경원 세포나 내피세포로 분화할 수 있도록 한다. 정상 개에서 자가 AT-PDGFRβ+세포의 경동맥 주입은 무증상 혈전색전증 이외에는 유의한 부작용은 없지만, 이 부작용을 극복하기 위해서는 세포용액의 농도를 세심하게 변형할 것이 추천된다. 결론적으로 고장성 만니톨의 전처치후 AT-PDGFRβ+세포의 경동맥 주입은 만성뇌졸중의 세포기반 신경재생치료에서 유용한 치료전략이 될 수 있다.

Adipose tissue-originated pericyte with platelet-derived growth factor receptor β positivity (AT-PDGFRβ+) is a multipotential mesodermal stem cell which is promising for a cell-based neurorestorative therapy. The current study of chronic ischemic rat model was conducted to test whether hyperosmolar mannitol enhances intracarotid delivery of AT-PDGFRβ+ cells and to investigate whether contralaterally infused AT-PDGFRβ+ cells would reach ischemic hemisphere and differentiate into neuronal or endothelial cells. The safety of the intracarotid injection of hyperosmolar mannitol and autologous AT-PDGFRβ+ cells was additionally tested for a non-ischemic normal canine model. For the chronic ischemic rat model, 1.4M mannitol (2mL, 0.1mL/sec) and 2x106 human AT-PDGFRβ+ cells (n=9), or injection of 2x106 human AT-PDGFRβ+ cells alone (n=6) were infused in the contralateral carotid artery at three weeks after ischemia. AT-PDGFRβ+ cells were found in the non-ischemic hemisphere and the corpus callosum at day 3, and in the ischemic hemisphere at day 7 under the condition of mannitol pretreatment. However, without mannitol pretreatment, only a few AT-PDGFRβ+ cells were observed in the infarct areas at day 7. At day 28, the surviving AT-PDGFRβ+ cells in the ischemic hemisphere were located mainly in the perivascular space, and were immunostained with endothelial barrier antigen (EBA

~65%), alpha smooth muscle actin (αSMA

~40%) or neurofilament (~20%). Normal canines (25kg, n=6) underwent intracarotid injection of hyperosmolar mannitol (20%, 50mL, 1g/kg) followed by 5x106 autologous AT-PDGFRβ+ cells. In the original protocol (protocol 1, n=2), cells mixed with 2mL of normal saline were infused for 1 minute by hand injection. In the modified protocol (protocol 2, n=4), cells mixed with 50mL of normal saline and 1,000 unit of heparin, were dripped slowly during 10 minute. During the procedure, vital signs of mean arterial pressure, heart rate, and O2 saturation were stable. On blood test, the level of leukocyte, hematocrit, calcium, potassium, albumin and total protein was decreased, but the other blood count, electrolyte, liver and renal batteries were within normal range including CRP. Although all canines were free from neurologic deficit and showed arterial patency on serial angiogram, brain MRI demonstrated multiple ischemic lesions in one canine (protocol 1

1 out of 2) and a single transient small ischemic lesion in one canine (protocol 2

1 out of four). In canine brain sections, AT-PDGFRβ+ cells were detected in both ipsilateral and contralateral cortex, which was more frequent at ipsilateral and frontal location. AT-PDGFRβ+ cells were also detected within infarcted area, and their location was perivascular spaces (70%), outside vessels (20%), and within vessels (10%), regardless of infracted area or not. In summary, hyperosmolar mannitol enhanced the entrance of contralaterally infused human AT-PDGFRβ+ cells into chronic ischemic rat brain by transient opening of blood-brain-barrier, and human AT-PDGFRβ+ cells subsequently migrated across corpus callosum into the ischemic hemisphere and differentiated into neuronal or endothelial cells. The intracarotid injection of autologus AT-PDGFRβ+ cells in normal canines did not develop serious adverse events except for silent thromboembolism. To reduce the thromboembolic complication, additional modification is required for cell pellet concentration. The intracarotid infusion of AT-PDGFRβ+ cells under the hyperosmolar mannitiol pretreatment is a feasible therapeutic approach in chronic stroke.