생체 외 및 생체 내 실험을 통한 휘트로카이트의 생체적합성 및 골형성 평가

Abstract

목적: 생체 내 및 생체 외 실험을 통하여 휘트로카이트(whitlockite: Ca18Mg2(HPO4)2(PO4)12, WH)의 생체적합성 및 골형성 능력을 기존에 잘 알려진 수산화인회석(hydroxyapatite: Ca10(PO4)6(OH)2), HAP) 및 삼인산칼 슘(beta tricalcium phopshate: Ca3(PO4)2, β-TCP)과 비교하여 평가하고자 하였다.

대상 및 방법: 1. WH, HAP, 및 β-TCP를 생체 외 실험에 적합한 원기둥형(지름 10mm, 높이 2mm)과 생체 내 실험에 적합한 과립형(지름 1mm, 기공크기 300µm) 모양으로 제조하였다. 2. 생체 외 실험은 인간 골수유래 간엽줄기세포(human mesenchymal stem cells: hMSCs)를 계대배양하여 세가지 물질로 제조한 원기둥형 시편에 분주하여 1, 3, 7일 동안 배양하였고 각 시기별로 MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-y)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazo-lium, inner salt) assay를 통하여 WH의 생체적합성을 평가하였다. 또한 WH의 생체 외 골유도 능력을 평가하기 위하여 hMSCs를 세가지 물질로 제조한 원기둥형 시편에 분주한 뒤 3, 7, 10일 동안 골분화 배지에서 분화시켜 각 시기별로 alkaline phosphatase (ALP) assay를 시행하였고, 14일째에는 real-time PCR을 시행하여 골분화 과정에서 특이하게 발현하는 지표들인 ALP, runt-related transcription factor 2 (Runx-2), collagen-I (COL-I), osteocalcin (OCN) 등의 유전자 발현 정도를 측정하고 비교 분석하였다. 3. 생체 내 실험은 대조군, WH군, HAP군 및 β-TCP군 등 네 개 군으로 나눠서 랫드 복부이식과 두개골 결손 모델 실험을 시행하였으며 복부이식 모델은 8주, 두개골 결손모델은 6주 사육 뒤 실험동물들을 희생시키고 채취한 샘플들은 미세 전산화 단층촬영(micro-CT)과 조직 학적 검사를 통하여 WH의 골유도 및 골형성 능력을 비교 평가하였다.

결과 1. MTS assay 결과 세 개 군에서 원기둥 시편 위에 분주한 세포들이 1, 3, 7일까지 모두 세포증식이 진행 되었으며 군간 통계적 차이는 없었다. ALP 활성도는 세 개 군에서 모두 분화 3, 7, 10일까지 시간이 지남에 따라 증가하였으며 군간 통계적 차이는 없었다. 분화 14일째 골분화 관련 유전자 발현 정도를 real-time PCR을 이용하여 측정한 결과 Runx-2는 WH가 β-TCP 또는 HAP에 비해 유의하게 높았으나 β-TCP와 HAP 사이에는 유의한 차이가 없었다. ALP, COL-I 또는 OCN의 유전자 발현 정도는 각군 사이에 통계적 차이는 없었지만 WH가 다른 군에 비해 수치상 높은 양상을 보였다. 2. 랫드 복부이식 실험결과 micro-CT 및 조직검사상 네 개 군에서 모두 신생골 형성이 관찰되지 않았다. 랫드 두개골 결손 모델에서 micro-CT상 WH의 이식체 흡수 정도가 HAP와 β-TCP 흡수의 중간 정도였고 percent bone volume (BV/TV)은 시편을 이식한 군들이 대조군에 비해 유의하게 높았으며 WH의 BV/TV값이 가장 높았고 β-TCP의 BV/TV 값이 가장 낮았다. Bone surface/volume ratio (BS/BV)값과 trabecular numbers (Tb.N)값도 시편을 이식한 군에서 대조군에 비해 역시 유의하게 높았지만 시편을 이식한 세 개 군 사이에는 통계적 차이가 없었다. Trabecular separation (Tb.Sp)값과 degree of anisotropy (DA)값은 모두 시편을 이식한 군에서 대조군 보다 유의하게 낮았으나 시편을 이식한 세 개 군 사이에는 통계적 차이가 없었다. Trabecular bone pattern factor (Tb.Pf), trabecular thickness (Tb.Th)와 structure model index (SMI) 등 지표들은 네 개 군에서 유의한 차이가 없었다. 랫드 복부이식 탈회 조직검사상 네 개 군에서 모두 신생골 형성이 관찰되지 않았지만 시편을 이식한 세 개 군에서 모두 시편 주위에 조골세포와 유사한 세포들의 부착이 관찰 되었다. 랫드 두개골 결손 모델 비탈회 조직검사 결과 시편을 이식한 세 개 군에서 대조군에 비해 모두 신생골 형성이 뚜렷하게 관찰 되었으며, 고배율에서 시편 주위에 대량의 조골세포와 유사한 세포 및 단핵세포의 부착이 관찰 되었다.

결론: 생체 외 및 생체 내 실험결과 WH는 기존에 훌륭한 생체 적합성으로 잘 알려진 HAP 또는 β-TCP보다 못지 않은 생체적합성 및 골형성 능력을 보여 주었다. 특히 생체 내 흡수율은 WH가 생체 내에서 흡수가 잘 되지 않는 HAP와 생체 내 흡수가 빠른 β-TCP의 중간 정도여서 적절한 생체 내 흡수율을 보여 주였다. 따라서 이러한 생체 적합성이 뛰어난 나노 재료는 향후 골 이식이나 골 시멘트, 약물 운반체 등 여러 영역에서 널리 사용이 가능할 것으로 사료된다.

색인 단어: 휘트로카이트(whitlockite), 수산화인회석(hydroxyapatite), 삼인산칼슘(β- tricaltium phopshate), 생체적합성