탈세포화, 항독소화 처리 후 고정된 우심낭 절편의 alpha-GAL knockout mouse에 이식후 평가

Abstract

글루타르알데하이드로 고정한 이종 조직을 인체 내에 장기간 이식 시 발생하는 기능 부전의 주된 원인은 석회화이며, 이는 심혈관 수술에 사용되는 이종 조직 이식편의 내구성을 감소시키는 중요한 요인들 중 하나이다. 본 연구에서는 alpha-Gal Knock out(KO) (alpha-1,3-galactosyltransferase knockout) 마우스를 이용함으로써 인체에 이식된 우심낭과 유사한 면역학적 환경하에서, 이식 후 발생할 수 있는 면역 반응 및 석회화의 정도를 알아보고자 하였으며, 우심낭에 대한 SDS(sodium dodecyl sulfate) 및 저장성 용액을 이용한 무세포화 처리 후 통상농도 및 고농도의 글루타르알데하이드를 이용한 고정 및 아미노산(lysine)처리의 항석회화 효과를 검증해보고자 하였다. 우심낭 조직의 고정 방법에 따라 4개의 실험군을 설정하였다. 1군은 0.5% glutaraldehyde(GA)를 사용하여 고정하였고 2군은 2% GA를 사용하여 고정하였으며 3군은 0.5% GA 고정 후에 lysine 처리를 하였다. 4군은 유기용매에서 2% GA 고정 후 lysine 처리를 하였다. 각 군에는 SDS를 첨부한 저장성 용액으로 무세포화 처리한 군과 하지 않은 군으로 나누어 총 8개의 군을 설정하였다. 처리한 조직들을 열 안정성 시험, 인장 시험, 지질성분 분석, 아미노산 분석을 시행하였다. 처리한 심낭 조직들을 alpha-Gal KO 마우스의 피하에 3개월간 이식하였으며, 이식 전, 이식 후 2주, 6주 및 12주의 마우스 혈중 항-alpha-Gal 항체를 측정하였다. 이식 후 수거한 조직들에 대한 조직학적 검사 및 면역조직화학 검사를 시행하였고, 칼슘 및 무기인의 함량을 측정하였다. 이식 전 검사에서 수축 온도의 차이는 없었으며 인장 강도는 무세포화 처리 유무에 따른 차이가 없었으나(p=0.12), 파단시 신장율은 무세포화 처리를 하게 되면 의미있게 감소하였다(p=0.002). 조직 내 총 콜레스테롤 함량은 무세포화 처리를 한 군에서 낮은 경향을 보였고 트리글리세라이드 함량 또한 무세포화 처리를 한 군에서 전반적으로 낮게 측정되었다(p=0.02). 이식 후 검사에서 칼슘 함량은 무세포화를 실시한 군 전체에서 2.0 ± 1.4μg/mg, 실시하지 않은 군 전체에서 4.5 ± 4.9μg/mg로 무세포화 처치를 하면 칼슘 함량이 의미 있게 감소하였으며(p=0.02), 무기인 함량은 무세포화를 실시한 군 전체에서 3.3 ± 0.9μg/mg, 실시하지 않은 군 전체에서 5.3 ± 2.7μg/mg로 통계적으로 유의한 차이가 있었다(p=0.04). 고농도의 글루타르알데하이드로만 고정한 2군에서는 1군에 비해 칼슘(p=0.01) 및 무기인(p=0.02) 함량이 높았다. 면역조직화학 검사에서는 전체적으로 주변부에서 염증세포의 침윤이 관찰되었지만 IgG, IgM 항체의 침착은 모든 군에서 관찰되었다. 마우스 혈중 항-alpha-GAL 항체의 역가는 IgM의 경우, 무세포화 처리한 군에서는 6주 이후에 역가가 증가하지 않았으나, 무세포화 처리 하지 않은 군에서는 12주에도 지속적으로 의미있게 증가하였고(p=0.02), IgG의 경우 두 군 모두에서 12주에도 증가하는 양상을 보였다(p<0.01). 무세포화 처리 후 alpha-Gal KO 마우스에 이식된 우심낭은 항석회화 효과를 보였으며 유기 용매 환경하에서 글루타르알데하이드 고정 후 Lysine에 의한 항독소화 처치를 하게 되면 항석회화 효과는 더욱 증가하였다. 고농도의 글루타르알데하이드만을 이용한 고정방법은 항석회화 측면에서 불리하였다. 또한, 무세포화 한 군에서는 6주 이후 IgM은 증가하지 않으나 IgG는 여전히 증가하는 양상으로 우심낭의 alpha-Gal에 대한 마우스의 만성적인 면역 반응이 일어나고 있음을 알 수 있었다. 이와 같이 이종 조직의 이식에 있어 무세포화 처리는 항석회화에 효과가 있으며 이종 조직에 대한 조기 항체의 발현을 감소시킨다는 데에 의의가 있다고 하겠다.