Regulation of calcium influx and signaling pathway in cancer cells via TRPV6-Numb1 interaction

Abstract

서론: 칼슘은 세포신호전달에 중요한 요소이며 다양한 질병에서 항상성이 변화되어 있다. 세포내 칼슘은 다양한 조절인자에 의해 항상성을 유지하고 있다. 여러 조절인자중에서 Transient Receptor Potential Vanilloid 6 (TRPV6)는 칼슘을 선택적으로 투과시키는 이온채널로서 소장의 칼슘 흡수에 중요한 역할을 한다. TRPV6는 여러암에서 과발현된다고 보고되고 있으며 발암유전자로서의 가능성이 대두되고 있지만 정확한 기전은 아직 연구되어 있지 않다. Numb 은 세포운명 결정인자로서 p53을 안정화시키는 암억제유전자로 알려져 있다. 방법: TRPV6의 활성을 측정하기 위한 전기생리학적인 칼슘유입분석법을 사용하였으며 단백질 상호작용을 연구하기 위하여 상호면역침전방법과 FRET분석법을 사용하였으며 MTT시약을 이용하여 세포성장을 측정하였다. 결과: HEK293 세포주에서 TRPV6와 Numb을 과발현시켰을때 TRPV6의 활성이 저해되는것을 관찰하였고 TRPV6가 과발현된 HEK293 세포주에서 Numb의 발현을 siRNA로 줄였을때 TRPV6의 활성이 증가하는것을 확인하였다. 상호면역침전과 FRET분석을 통해 두 단백질이 상호작용하는것을 확인하였다. 두 단백질의 결합부위를 찾기 위하여 각각의 부위가 없는 돌연변이를 제작하였으며 이 돌연변이를 이용하여 상호면역침전실험을 수행한 결과 TRPV6의 716번째 아미노산인 Aspartic acid와 Numb의 434번째 아미노산인 Arginine이 결합에 핵심적인 부위인것을 확인하였고 두 단백질사이의 결합이 활성조절에 중요한것을 관찰하였다. 유방암 세포주인 MCF-7 에서 Numb 의 발현이 TRPV6의 활성을 조절하여 세포내 칼슘유입을 조절하며 세포성장에 영향을 미치는 결과를 확인하였다. 전립선암세포주(PC-3)와 MCF-7 세포주에서 TRPV6에 의한 칼슘유입이 MAPKinase, GSK3ß 신호전달과정을 활성화시켜 세포성장을 조절하는 것을 Western blotting 실험으로 확인하였다. 결론: 실험결과를 통해 Numb이 TRPV6와 상호작용하여 활성을 조절하는 새로운 인자인것을 밝혔으며 암세포에서 세포내 칼슘과 세포성장을 조절하는것을 확인하였다. 더욱이 칼슘유입에 의한 암세포내 세포성장과 관련된 신호전달과정을 확인함으로써 칼슘채널이 암 치료의 대상이 될 수 있는 증거를 제시하였다.

Introduction: Calcium is a critical factor in the regulation of signal transduction and calcium homeostasis is altered in different human diseases. The level of calcium in cells is highly regulated through a diverse class of regulators. Among them is the Transient Receptor Potential Vanilloid 6 (TRPV6), which is a calcium selective channel that absorbs calcium in the small intestine. TRPV6 is overexpressed in some cancers and exhibits oncogenic potential, but its exact mechanism is still poorly understood. The Numb protein is a cell fate determinant that functions in endocytosis and as a tumor suppressor via the stabilization of p53. Methods: We used calcium influx assay to measure activity of TRPV6, To validate interaction, I used co-immunoprecipitation (co-IP) and FRET assay. Using site directed mutagenesis, I constructed deletion mutants. Other molecular biology techniques (Western blotting, MTT assay, Cell culture, Surface biotinylation, Transfection, siRNA) were used. Results: The expression of Numb1 decreased cytosolic calcium concentrations in TRPV6-transfected HEK293 cells. When all the isoforms of Numb were depleted using siRNA in a TRPV6 stable cell line, the levels of cytosolic calcium increased. We observed an interaction between Numb1 and TRPV6 using co-IP. We confirmed this interaction using Fluorescence Resolution Energy Transfer (FRET). We identified the TRPV6 and Numb1 binding site using TRPV6 c-terminal truncation mutants and Numb1 deletion mutants. The binding site in TRPV6 was an aspartic acid at amino acid residue 716, and that binding site in Numb1 was arginine at amino acid residue 434. A Numb1 mutant, lacking TRPV6 binding activity, failed to inhibit TRPV6 activity. Every isoform of Numb knockdown, using an siRNA-based approach in MCF-7 breast cancer cells, not only showed enhanced TRPV6 expression but also both the cytosolic calcium concentration and cell proliferation were increased. The down-regulated expression of TRPV6 using siRNA increased Numb protein expression

however, the cytosolic influx of calcium and proliferation of the cell were decreased. To examine downstream signaling during calcium influx via TRPV6, we performed western blotting analysis on TRPV6 upregulated cancer cells (MCF-7, PC-3). we showed that influx of calcium via TRPV6 phosphorylates not only GSK3ß, JNK and Erk in MCF-7 but also p38 in PC-3 cells. Conclusions: Taken together, these results demonstrated that Numb1 interacts with TRPV6 through charged residues and inhibits its activity via the regulation of protein expression. Moreover, we provided evidence for a calcium-regulated cancer cell signaling pathway and that the calcium channel is a target of cancer cells.