Regulatory mechanisms of inwardly rectifying K+ channel (Kir2.2) by lipopolysaccharide in human monocytes

Abstract

선천성 면역 (innate immunity)에 관여하는 단핵구 및 대식세포는 여러 수용체 자극에 의해 활성화된다. 그람 (Gram) 음성균의 세포막 구성성분인 지질다당질 (LPS)은 이들 세포에 발현되어 있는 Toll-like 수용체 (TLR4)에 의해 인식되며, 활성화 매개물질로 널리 사용되고 있다. 단핵구의 분화 및 활성화에서 포타슘 이온통로의 변화가 다양함에도 불구하고, 그의 역할 및 기전에 관한 연구는 잘 알려져 있지 않다. LPS자극한 단핵구에서 전압 의존성 포타슘 이온통로 (Kv)와 칼슘 의존성 포타슘 이온통로 (KCa)의 전도도는 자극 6 시간 이후부터 각각 증가 또는 감소하였다, 뿐만 아니라, LPS 자극 이전에는 거의 관찰되지 않던 내향 정류성 포타슘 이온통로 (Kir)의 전도도는 자극 4 시간에서 최대로 증가하며, 그 이후부터 24 시간까지 자발적으로 감소하는 것을 확인하였다. 따라서, 본 연구에서는 사람 단핵구에서 LPS 자극에 의한 Kir 이온통로의 역할 및 기전을 관찰하였다. LPS 자극에 의해 증가되는 Kir 전류는 단일 이온통로 전도도 (37.7 pS)와 바륨 (Ba2+)에 의한 억제효과 (IC50, 1.42 μM)로 Kir2.2의 특성임을 알았으며, Kir2.2의 단백질 발현도 새롭게 확인하였다. THP-1에서 관찰되는 Kir2.2는 사람 말초혈액에서 분리한 단핵구에도 존재하며, LPS 자극에 의해서 유사한Kir 전류변화를 확인하였다. LPS에 의한 Kir2.2 전류 증가는 세포의 안정막 전위를 과분극시키는 특성에 따라store-operated Ca2+ entry (SOCE)를 증가시키며, TNFα 및 IL-8과 같은 사이토카인 분비에 관여한다. LPS에 의한 Kir2.2전류 증가는 세포막에서 Kir2.2이온통로가 증가하는 것으로 보아, 세포막으로의 이동에 의한 것임을 알 수 있었다. 위상차 현미경을 통해 Kir2.2의 막이동을 확인하였으며, 이러한 현상은 막단백질의 이동을 억제 (Exo-1 과 Brefeldin A)시켜 차단됨을 확인하였다. 또한, Kir2.2의 막이동은 단백질 인산화효소 C (PKC) 억제제와 siPKCε에 의해 차단되는 것으로 PKCε 의존적임을 알 수 있었다. 세포막으로 이동하는 Kir2.2는 계속 증가함에도 불구하고, 4 시간 이후부터는 Kir 전도도가 자발적으로 감소하였다. LPS/TLR4 자극 신호는 PI3K를 활성화 시키며, 이는 PIP2를 PIP3로 전환하여 Akt/PKB 경로를 활성화한다. 이때 감소하는 PIP2에 의해Kir2.2의 활성도가 조절 받는 것으로 생각된다. 자발적으로 감소하는 Kir 전류는 PI3K 억제제 (LY294002와 wortmannin)에 의해 다시 회복되며, Akt 억제제는 어떠한 영향을 미치지 않는 것으로 보아, 직접적인 PIP2 감소가 Kir2.2 전류 감소를 유발하는 것을 알 수 있다. 본 연구를 요약하면, 사람 단핵구에서 LPS 자극에 의한 Kir전도도의 증감현상은Kir2.2의 PKCε의존적인 세포막 이동과 PI3K 활성화에 의한 PIP2 감소가 복합적으로 일어나는 현상임을 알 수 있다. 또한, Kir2.2전류의 변화는 세포막 전위의 과분극을 일으켜 세포 내 Ca2+ 유입 및 사이토카인 분비를 조절하는 것으로 보인다. 이는 박테리아 등의 감염에 의한 선천성 면역반응에서 단핵구의 중요한 생리학적 역할을 이해하는데 크게 기여할 수 있을 것이다.

Lipopolysaccharide (LPS) is effectively and widely used to stimulate Toll-like receptor 4 (TLR4) in monocyte. Ion channels are involved in the physiological and immunological responses of monocytes/macrophages. K+ channels establish the negative polarized membrane potential and are critical for ion homeostasis in a variety of cells including monocytes. However, investigation on K+ channels affected by LPS in monocyte is not completely understood. In THP-1 human monocytes treated with LPS (1 μg/ml), therefore, time-dependent changes of K+ channels were investigated. Voltage-gated K+ channel current (IKv) was decreased while Ca2+-activated K+ channel current (IKCa) was increased after 6 h of LPS stimulation. Interestingly, inwardly rectifying K+ channel current (IKir) was absent in the control cell, whereas it was appeared newly from 1 h, peaked at 4 h (-119 ± 8.6 pA/pF), and decayed to 27% of the peak at 24 h. Despite the presence of Kir2.1 and Kir2.2 mRNAs and proteins, the single channel conductance (38 pS) and Ba2+ sensitivity (IC50, 1.42 μM) were consistent with Kir2.2. The functional upregulation of Kir2.2 was also confirmed in freshly isolated primary human monocytes. The results of immunoblot and confocal microscopy showed membrane translocation of Kir2.2 in LPS-treated monocytes whereas Kir2.1 expression is mostly retained in cytosolic. Moreover, IKir,LPS was attenuated by the vesicular trafficking inhibitors. Both IKir,LPS and plasma membrane translocation of Kir2.2 were inhibited by GF109203X (PKC inhibitor) or by transfection with siPKCε. Store-operated Ca2+ entry was augmented in the LPS treated THP-1, which was abolished by high K+-induced depolarization. LPS-induced cytokine release (TNFα and IL-8) was weakened by ML-133, a selective Kir2 inhibitor. The spontaneously decayed IKir,LPS at 24 h was reversed by PI3 kinase (PI3K) inhibitors (wortmannin and LY294002). In contrast, IKir,LPS at 24 h was further suppressed by bpV(phen), an inhibitor for PTEN (PIP3 phosphatase). However, IKir,LPS at 24 h was not affected by Akt inhibitor, suggesting that the decay of IKir,LPS was due to the decreased availability of PIP2 itself, i.e. conversion into PIP3 by PI3K. Dynamic reciprocal changes between PIP2 and PIP3 by inhibitors of PI3K and PTEN were confirmed using confocal microscopy for PLCδ-PH-GFP and Akt-PH-GFP expressed THP-1 cells treated with 24 h of LPS. Taken together, to the best of our knowledge, these data are the first demonstration that Kir2.2 is functionally upregulated by TLR4 stimulation via PKCε-dependent membrane trafficking in human monocytes. And then, its current is spontaneously decayed by decreased availability of PIP2 that is known to be critical for Kir2 activity. The augmentation of Ca2+ influx and cytokine release suggests a physiological role for Kir2.2 in the innate immunity of monocytes.