Multiplex Molecular Target Detection in a Colorectal Cancer Xenograft Model Utilizing Simultaneous Fluorescence-Raman Endoscopic System

Abstract

목적: 형광 영상을 이용한 내시경 영상은 분자 표적에 대한 빠른 정보를 제공하며, 라만 영상을 이용한 내시경 영상은 다중 분자 표적에 대한 확인을 할 수 있다. 본 연구진은 형광-라만 동시 내시경 장비를 개발하여, 이를 대장직장암 마우스 모델에 적용하고 그 효용성을 확인해 보고자 하였다. 이번 연구에서 우리는 형광-라만 동시 내시경 장비의 다중복합 생체분자표적 감지 (종양 세포와 종양 미세환경 표적), 내시경 모델에의 적용, 장비의 민감도와 라만 영상 강도의 정량화 가능성을 확인해 보았다.

방법: 형광-라만 동시 내시경 장비는 상용화된 공초점 내시경을 개조하여, 형광과 라만 영상을 실시간으로 동시에 확인할 수 있도록 하였다. 또한 표피생장인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR)와 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)를 발현하는 대장직장암 마우스 모델을 만들었다. 대장직장암 마우스 모델에 항체(EGFR과 VEGF)를 도입한 형광과 표면 증강 라만을 함께 내는 나노입자(fluorescence and surface-enhanced Raman scattering nanoprobes, F-SERS dots)를 분무하여 다중복합 생체분자진단이 가능한지 확인하여 보았다. 또한 형광-라만 동시 내시경 장비를 이용한 마우스 내시경 모델을 확립하여 이에 대한 다중복합 생체분자진단 가능성을 확인하였다. 더욱이 1 센티미터 이하의 작은 대장직장암 마우스 모델을 만들어 형광과 표면 증강 라만을 함께 내는 나노입자의 용량을 줄였을 경우 형광-라만 동시 내시경 장비의 민감도를 확인해 보았다.

결과: 형광과 라만 동시 내시경 영상을 대장직장암 마우스 모델에서 확인할 수 있었다. 대장암의 복합 분자 신호(EGFR 과 VEGF)는 형광-라만 동시 내시경 영상에서 형광 영상[Alexa Flour (AF) 610]을 이용해 빠른 신호 확인이 가능하였으며, 라만 영상[rhodamine B isothiocyanate (RITC) 와 fluorescein isothiocyanate (FITC)]을 이용해 다중 분자 신호를 감지할 수 있었다. 또한 형광-라만 동시 내시경 영상은 종양을 노출시킨 경우 뿐만 아니라, 실시간 내시경 검사에서도 다중복합 생체분자 진단이 가능하였다. 형광-라만 동시 내시경 영상의 유용성은 1 센티미터 이하의 종양에서도 확인할 수 있었으며, 나노입자의 용량을 반으로 줄여도 민감도에 큰 차이가 없었다. 라만 신호의 강도는 라만 신호의 높이를 측정하여 정량화 할 수 있었고, F-SERS dot의 농도 증가에 따라, 그리고 세포의 밀도와 분자 특성 발현 증가에 따라 증가하는 경향을 보였다.

결론: 우리는 형광-라만 동시 내시경을 이용해 빠른 신호 확인과 다중 분자 신호 감지가 가능함을 생체 내에서 확인하였다. 종양 세포막에 존재하는 EGFR을 통해 종양 세포 영상을 획득하고, 세포 외 기질에 존재하는 VEGF를 통해 종양 미세환경 영상을 획득함으로써 다중복합 생체분자 영상을 실시간으로 얻을 수 있었다. 또한 대장직장암 모델에서 실제 내시경 검사법을 형광-라만 동시 내시경을 이용해 구현하여, 다중 분자 신호 감지가 가능함을 보였다. 더욱이 형광-라만 동시 내시경의 민감도가 종양 크기 1 cm 이하이며, 나노입자 농도 5 나노몰 정도임을 확인하였다. 나노입자의 독성은 나노입자의 무독성 코팅, 국부 분무, 그리고 종양 크기에 따른 나노입자의 용량 감소 등을 통해 감쇄할 수 있어, 우리의 형광-라만 동시 내시경 장비를 인체에 쉽게 적용 할 수 있을 것으로 기대한다. 또한 형광-라만 동시 내시경을 이용할 경우 라만 신호의 강도 계산을 통해 종양의 이질적인 분자 특성을 정량화할 수 있는 가능성을 보였다.

Purpose: Fluorescence endomicroscopy provides quick access to molecular targets, while Raman spectroscopy allows the opportunity to detect multiplex molecular targets. We have developed a simultaneous fluorescence-Raman endoscopic system (FRES) and herein demonstrate its value in an orthotopic colorectal cancer (CRC) xenograft model. In this study, we identified multiplex targeting ability (both tumor cell and tumor microenvironment targeting), applicability in a real-time endoscopic model, sensitivity, and quantification possibility of the FRES.

Methods: The FRES was constructed by modifying a commercialized confocal laser endomicroscope to provide simultaneous fluorescence and Raman signals in real-time. In a CRC xenograft model, epidermal growth factor receptor (EGFR) and vascular endothelial growth factor (VEGF) were targeted with antibody-conjugated fluorescence and surface-enhanced Raman scattering nanoprobes (F-SERS dots) to evaluate the efficacy of the FRES. In addition, we assessed the multiplex molecular targeting ability in a real-time endoscopic model. Moreover, we established subcentimeter-sized small CRC model and identified sensitivity by reducing the F-SERS dots.

Results: Simultaneous fluorescence and Raman signals detection was achieved by the FRES. The FRES was useful for fast signal detection [by fluorescence signal

Alexa Fluor (AF) 610] and multiplex targeting [by Raman signals

rhodamine B isothiocyanate (RITC) and fluorescein isothiocyanate (FITC)] using EGFR and VEGF antibody-conjugated F-SERS dots in an orthotopic CRC xenograft model on tumor-exposed and real-time endoscopic systems. In addition, the FRES showed a multiplex targeting ability, even in a subcentimeter-sized CRC, using a half spraying dose of antibody-conjugated F-SERS dots. Raman signal intensity was quantified by measuring highest height of Raman signal, and showed linear increased tendency according to dose of antibody-conjugated F-SERS dots, seeded cell density and expression of molecular characteristics.

Conclusions: Our results demonstrate that FRES showed fast signal detection and a multiplex targeting ability by fluorescence and Raman signals, respectively. By the FRES, tumor cell (EGFR in CRC cell membrane) and tumor microenvironment (VEGF in extracellular matrix) could be simultaneously assessed, and can be applied to real-time endoscopic system. In addition, the multiplex targeting ability of FRES was applicable even to subcentimeter-sized tumors at a low concentration of F-SERS dots (5 nmole). The toxicity of the nanoprobes used can be reduced by using a nontoxic coating, as well as a topical spray, and by a dose reduction in antibody-conjugated F-SERS dots. Lastly, Raman intensity could be quantified and showed the possibility to measure the molecular heterogeneity of the tumor.