Production of 2,3-butanediol from glucose and galactose in engineered Saccharomyces cerevisiae

Abstract

2,3-Butanediol (2,3-BD)는 산업적 활용도가 높은 플랫폼 화학 소재이다. 2,3-BD는 화학적 생산이 가능하지만 유가 변동문제와 지구온난화 문제로 인해 최근 바이오 기술이 개발됨에 따라 생물공학적으로 생산이 주목 받고 있다. 2,3-BD의 생물공학적 생산에는 주로 박테리아가 사용되는데 고 수율로 2,3-BD를 생산할 수 있지만 이들 대부분이 병원성 박테리아로 분류되기 때문에 안전과 산업화 측면에서 대량 생산 공정 구축이 어렵다. 그 대안으로 GRAS (Generally Recognized As Safety) 미생물로서 안전하다고 알려진 Saccharomyces cerevisiae를 이용한 2,3-BD 생산에 주목할 필요가 있다. 하지만 S. cerevisiae는 자연 상태에서는 2,3-BD를 거의 생산하지 못하고 에탄올을 주로 생산하기에 고효율의 2,3-BD를 생산하기 위해서는 대사공학적 방법을 이용한 재조합 S. cerevisiae의 구축이 요구된다. 또한, 경제적 측면으로 볼 때 해양 바이오매스로부터 2,3-BD를 생산하는 것이 2,3-BD의 지속 가능한 상업화를 위해 해결해야 할 주요 연구 과제이다. 하지만 S. cerevisiae는 해양 바이오매스에 다량 존재하는 포도당과 갈락토오스를 동시에 소모하지 못하고, 포도당이 모두 소모된 후에야 갈락토오스가 이용되는 포도당에 의한 전사 억제 (catabolite repression)의 단점을 가진다. 선행연구자에 의해 S. cerevisiae의 주요 대사 산물인 에탄올 생성을 억제하고자 pyruvate decarboxylase 활성이 완전히 저해된 효모 (SOS2)와, SOS2 균주를 포도당 배지에서 생장이 가능하도록 하기 위해 이볼루션시킨 효모 (SOS4)를 제작한 바 있다. 이볼루션의 과정에서 SOS4 균주는 S. cerevisiae 내 포도당 signal regulator의 역할을 하는 MTH1 유전자의 아미노산 염기서열에 돌연변이가 발생하였다. 본 연구에서는 해양 바이오매스에 다량 존재하는 포도당과 갈락토오스를 효율적으로 이용하도록 하여, 2,3-BD의 생산에 있어 높은 수율과 생산성을 얻는 것이 최종 목표이다. 먼저, pyruvate decarboxylase 활성이 저해되고 이볼루션되어 MTH1 유전자에 돌연변이가 존재하는 균주 (SOS4)에 2,3-BD 생합성 경로를 도입한 균주 (BD4)의 회분식 배양을 통해 포도당과 갈락토오스의 동시 소모를 확인하였다. 따라서 이 결과가 MTH1 유전자의 돌연변이에 의한 효과인지를 확인하고자 이볼루션이 일어나지 않은 균주 (SOS2)와 인위적으로 MTH1 유전자에 돌연변이를 가하여 구축한 균주 (SOS2_Mth1)를 본 연구에 사용하였다. 이 두 균주에 2,3-BD 생합성 경로를 도입한 균주를 구축하였고, 회분식 배양 결과 MTH1에 돌연변이가 존재하는 균주 (BD2M)가 포도당과 갈락토오스를 동시에 소모함으로써 MTH1 와일드타입 균주 (BD2)에 비하여 2,3-BD의 생산성이 약 41% 증가한 수치를 보였다. 이 균주의 정확한 발효능력을 보기 위하여 fed-batch fermentation을 수행하였고, 마찬가지로 두 당을 동시 소모하여 약 75.5 g/L의 2,3-BD를 생산하였으나 발효 후반부로 갈수록 갈락토오스의 소모 속도가 느려지는 양상을 확인할 수 있었다. 두 번째로, 갈락토오스 소모 속도를 증진시키기 위해 갈락토오스 대사경로 내에 존재하는 5개의 유전자를 각각 과발현 시켜 균주를 구축하였다. 이들을 가지고 회분식 배양을 진행하였고, phosphoglucomutase를 암호화하는 PGM2 유전자를 과발현한 균주 (BD2M_PGM2)에서만 와일드타입 균주 (BD2M)에 비하여 약 13% 증가한 갈락토오스 소모 속도를 나타내었다. 이 균주의 정확한 발효능력을 보기 위하여 fed-batch fermentation을 수행하였고, 와일드타입 균주에 비해 약 42% 증가한 갈락토오스 소모 속도를 통해 약 39% 증가한 2,3-BD의 생산성을 확인할 수 있었다. 세 번째로, pyruvate decarboxylase 결여 효모의 단점인 탄소원에 의존적인 생장 체계를 극복하고자 선행연구자에 의해 확인된 Candida tropicalis 유래의 pdc1 유전자를 도입하고, 보효소 불균형으로 인해 부산물로 글리세롤이 다량 축적되는 문제점을 보완하고자 선행연구에 의해 확인된 Lactococcus lactis 유래의 noxE 유전자를 도입한 균주를 구축하였다. 이전 배양의 조건과는 달리 이 균주 (BD2M_PGM2_Ctnox)의 배양시에는 외부 탄소원으로 에탄올을 공급하지 않고 진행하였다. 회분식 배양 결과, 와일드타입 균주 (BD2M_PGM2)에 비하여 약 19% 감소한 글리세롤의 수율을 확인할 수 있었으며, 탄소원에 비의존적인 생장이 가능해짐을 확인하였다. 이 균주의 정확한 발효능력을 보기 위하여 fed-batch fermentation을 수행하였고, 최종적으로 약 115.7 g/L의 2,3-BD를 생산하였으며 부산물인 글리세롤의 수율이 0.08 gglycerol/gsugars로 매우 낮은 수치를 보였다. 본 발효에서의 2,3-BD 생산 수율은 0.47 g2,3-BD/gsugars, 2,3-BD 생산성은 1.75 g/L/h를 나타내었다. 이를 통하여 재조합 S. cerevisiae인 BD2M_PGM2_Ctnox 균주는 해양 바이오매스로부터 2,3-BD를 효율적으로 생산할 수 있는 균주임을 증명하였다.

주요어 : 2,3-Butanediol, pyruvate decarboxylase, 갈락토오스, 해양 바이오매스, 혼합당 발효, mth1, phosphoglucomutase, 포도당에 의한 전사억제, 보효소 불균형

2,3-Butanediol (2,3-BD) is a platform chemical with extensive industrial applications since it can be converted into other valuable chemicals by dehydration, dehydrogenation, ketalization and esterification. Especially, 1,3-butadiene, a dehydration product of 2,3-BD, is a main substance used for producing synthetic rubber. Most microbial fermentations for 2,3-BD production have been focused on pathogenic bacteria, which makes large-scale fermentations difficult in terms of safety and industrialization. As an alternative, 2,3-BD production by a GRAS (Generally Regarded As Safe) microorganism Saccharomyces cerevisiae would be suitable. Also, production of 2,3-BD from marine biomass is one of the key issues for economic viability of bio-based chemicals. Among various sugars, glucose and galactose are of special interest because they are abundant in marine biomass. One of the most important concerns in mixed sugar fermentations is the catabolite repression that represses the enzyme expression to utilize sugars other than glucose. Pyruvate decarboxylase(Pdc)-deficient S. cerevisiae (SOS2) was constructed to eliminate ethanol production. Then, the evolved SOS2 strain (SOS4) was obtained by serial cultivation in excess glucose medium for cell growth on glucose medium. Among the chromosomal mutations of the SOS4 strain, a single nucleotide polymorphism was found on the MTH1 gene which functions as a glucose signal regulator. Efficient 2,3-BD production using engineered strains capable of effective fermentation from glucose and galactose is the objective in this study. First, the 2,3-BD-producing Pdc-deficient BD4 strain with the MTH1 mutation was tested for a performance of 2,3-BD production in a batch fermentation, resulting in simultaneous utilization of glucose and galactose. Therefore, in order to evaluate if the MTH1 mutation affects the fermentation performances in a mixture of glucose and galactose, the evolved pdc-deficient strain (SOS2) and engineered strain by a point mutation on the MTH1 gene (SOS2_Mth1) were used. The SOS2 and SOS2_Mth1 strains containing the alsS gene encoding α-acetolactate synthase and the alsD gene encoding α-acetolactate decarboxylase both from Bacillus subtilis and overexpression of the endogenous BDH1 gene coding for 2,3-BD dehydrogenase were constructed (BD2 and BD2M) and tested for a performance of 2,3-BD production in batch fermentation under oxygen-limited conditions. The BD2M strain which is the MTH1 mutant was able to co-ferment both sugars, resulting in increased 2,3-BD productivity by 41% compared to the control strain, BD2 strain. To evaluate the fermentation aspects of the BD2M strain in a bioreactor, fed-batch fermentation was carried out to obtain 75.5 g/L of 2,3-BD by simultaneous consumption of glucose and galactose. However, in the rest of the fermentation, galactose consumption rate was substantially reduced compared with glucose consumption rate. Second, to increase galactose uptake rate in 2,3-BD production, the GAL10, GAL1, GAL7, PGM1 and PGM2 genes involved in the Leloir pathway were overexpressed into the BD2M strain. These five consutructed strains were tested for a performance of galactose consumption in batch fermentation under oxygen-limited conditions. Only the strain for overexpression of the PGM2 gene, the BD2M_PGM2 strain obtained 13% increased galactose uptake rate. Also, the BD2M_PGM2 strain resulted in 42% increased galactose uptake rate and 39% improved 2,3-BD productivity compared to the control strain, BD2M strain in a fed-batch fermentation. Finally, to decrease the accumulation of glycerol and to solve the C2-dependent growth in 2,3-BD-producing Pdc-deficient S. cerevisiae, the NADH oxidase (noxE) gene from Lactococcus lactis and the pyruvate decarboxylase 1 (pdc1) gene from Candida tropicalis were expressed in the BD2M_PGM2 strain. To test for a performance of 2,3-BD production, batch and fed-batch fermentation was carried out. Unlike other conditions of fermentations in this study, this cultivation was conducted without addition of ethanol due to expression of the pdc1 gene. The resulting strain (BD2M_PGM2_Ctnox) obtained 19% reduced yield of glycerol and was able to grow without addition of ethanol in a batch fermentation. Also, in a fed-batch fermentation, the resulting strain produced 116 g/L of 2,3-BD from glucose and galactose with a low glycerol yield (0.08 gglyerol/gsugars) with 0.47 g2,3-BD/gsugars of yield and 1.75 g/L/h of productivity in a fed-batch fermentation. These results suggested that the BD2M_PGM2_Ctnox strain is suitable for producing 2,3-BD from marine biomass for industrial applications

Keywords : 2,3-butanediol, pyruvate decarboxylase (Pdc), galactose, marine biomass, mixed sugar fermentation, mth1, phosphoglucomutase (Pgm2), catabolite repression, redox balance