Co-treatment Effect of Pulsed Electromagnetic Field with Human Dental Pulp Stromal Cells and FK506 on the Regeneration of Crush Injured Rat Sciatic Nerve

Abstract

연구 배경 및 목적 말초 신경의 압박 손상은 치과용 임플란트 매식술, 악안면 외상, 악교정 수술 등에 의해 치과계에서 점차 증가하고 있다. 신경손상에 도움을 줄 수 있는 방법으로 전자기장 (pulsed electromagnetic field. PEMF), 신경 보조인자 (neurotrophic factor), 세포치료등의 방법이 최근 많이 각광받고 있다. 전자기장은 처음 골 재생에 효과가 있다는 실험을 시작으로 신경 재생에 효과가 있다는 여러 논문들이 나오고 있다. 전자기장은 여러 가지 기전에 의해 신경재생에 도움을 줄 수 있다. 전자기장을 이용한 여러 실험에서 신경 재생에 효과가 있다고 보고되었고 골수 줄기 세포의 세포주기와 분화에 영향을 줘 신경재생에 도움이 되는 세포로 분화시키는 것이 가능하다는 보고도 있다. 또한 여러 실험에서 전자기장이 액손의 수와 너비를 증가시킨다는 실험도 보고되었다. 믈론 전자기장이 신경재생에 효과적이지 못하다는 반대의 보고도 있고 신경 재생에 도움을 준다 하더라도 정확한 기전이 밝혀지지는 않았지만 전자기장의 세기, 강도 및 시간에 따라 세포주기에 변화를 주는 것은 분명해 보인다. 또한 전자기장이 외부에서 신경 재생에 도움을 주기 위해 주입된 줄기세포의 세포주기나 환경을 변화시켜 더 오랜 시간 그리고 신경재생에 필요한 세포로 분화시키는데 도움이 된다는 일련의 연구들이 있다. 이렇게 신경재생에 도움을 주기 위하여 외부에서 유입된 세포들 중에서 치수기질세포(human dental pulp stromal cells. hDPSCs)는 조골모세포 (Bone marrow mesenchymal stem cell)와 비슷하게 신경 재생에 도움을 주는 슈반세포로 분화가 가능하지만 치수기질세포가 더 얻기 쉽고 분자량이 작아 신경에 주입하기가 더 쉬우며 신경세포 기원이라 신경 재생에 더욱 효과가 있을것이라는 연구들이 진행되면서 더욱 각광받고 있다. FK506도 단독으로 사용시에 신경 재생능력이 있다는 사실이 밝혀지고 있다. 이 실험은 신경재생에 도움을 주기 위하여 전자기장을 단독으로 사용하는 것보다는 전자기장이 외부에서 유입된 치수기질세포의 세포주기 및 분화도를 변화시켜 신경 재생에 더 좋은 효과를 얻고 FK506의 투여로 신경재생에 더 효과가 있을 것이라는 가설에서 시작하였다. 따라서 본 논문은 신경재생에 도움을 주기 위하여 전자기장(PEMF)의 세기를 결정하고 전자기장에 치수기질세포와 면역억제제인 FK506을 함께 투여함으로써 신경재생에 상승효과가 있는지를 조사하기 위해 시도되었다.

재료 및 방법 먼저 전자기장의 세기 변화에 의한 신경재생의 효과를 알아보기 위하여 15Gauss (G)와 30Gauss의 그룹으로 나누고 각각 2주와 4주에 걸쳐 전자기장을 투여하였다. 전자기장에 치수줄기세포와 FK506을 함께 넣어보는 실험은 control 그룹, PEMF 그룹, PEMF + FK506 그룹, PEMF + hDPSCs 그룹, PEMF + hDPSCs + FK506 그룹의 5가지 그룹으로 나누었다. 200-250g의 백서를 이용하여 전자기장은 15G 혹은 30G를 2주 혹은 4주간 60Hz의 강도로 조사하였다(1시간/day). 추후에 치수줄기세포를 확인하기 위하여 PKH26이 라벨된 치수기질세포를 이용하였고 사실 검증을 위해 SFI (Sciatic function index), 조직형태학적 관찰, RT-PCR을 이용하였다.

결과 전자기장을 압박 손상된 백서에 투여한 결과 전자기장을 투여한 군에서 전자기장을 투여하지 않은 군보다 나은 신경 재생 효과를 보였다. 또한 2주 혹은 4주의 전자기장 투여 결과는 비슷한 양상을 보였다. 15G와 30G의 비교에서는 유의한 차이를 보이지는 않았지만 15G에서 더 높은 신경재생 효과를 보였다. 따라서 15G를 일련의 실험에 전자기장의 세기로 선택하였고 2주간 조사하였다. 다음 실험은 신경재생에 효과를 보이는 여러 가지 인자, 즉 전자기장, 치수기질세포, FK506등을 조합하여 복합적인 신경 재생효과를 확인한 결과 FK506을 포함한 전자기장 투여군과 모두 투여한 군에서 높은 신경 재생의 효과를 보였다.

결론 본 연구를 통하여 PEMF + hDPSCs 그룹에서는 신경재생에 효과를 보이는 결과를 얻을 수 없었지만 PEMF + hDPSCs + FK506 그룹은 확실한 신경재생 효과를 보였다. 또한 전자기장의 세기에 따라 혹은 신경 손상 후 기간에 따라 신경 재생의 효과가 달라짐을 확인할 수 있었고 임상에서 치수기질세포를 포함한 전자기장을 이용하여 신경재생에 도움을 줄 수 있는 기초연구가 되었다. 그러나 신경재생의 효과가 시간이 오래 경과하면 효과가 떨어지거나 억제되는 양상도 보였고 정확한 신경재생 기전도 확인하지 못한 바, 향후 신경재생에 영향을 극대화 할 수 있는 기간 설정 및 이들 인자의 작용 기전에 관한 심도 있는 연구가 필요할 것으로 사료된다.

Background and Aims The incidence of peripheral nerve crush injury is continuously increasing in clinical dentistry, likely due to dental implantations, maxillofacial traumas or orthognathic surgeries. Various techniques, including the application of pulsed electromagnetic field (PEMF), cell therapy and neurotrophic factors, have been investigated to enhance peripheral nerve regeneration. This study was conducted to determine if exogenously delivered hDPSCs, with FK506 for immune suppression and neuropromotion, and combined with PEMF would be more beneficial for peripheral nerve regeneration than a modality based on PEMF only. We determined an effective stimulus condition for PEMF in terms of intensity and duration, and then evaluated the co-treatment effect of PEMF with hDPSCs and FK506 on nerve regeneration. Materials and Methods Male Sprague-Dawley rats (200–250g) were randomly distributed into 5 groups

the crush only control, and the PEMF 15G2week, PEMF 15G4week, PEMF 30G2week and PEMF 30G4week groups (n=6 in each group), in order to determine the optimal stimulus conditions in terms of PEMF intensity and duration. Freely moving rats in a plastic cage were placed in the PEMF device and exposed pulse trains with a 60Hz frequency and intensity of 15 or 30 Gauss for 1 hour daily for 2 or 4 weeks. To evaluate the co-treatment effect, rats were distributed into 5 groups (n=18 in each group)

the crush only control, PEMF, PEMF with FK506 (PEMF+FK506), PEMF with hDPSCs (PEMF+hDPSCs) and PEMF with hDPSCs and FK506 (PEMF+hDPSCs+FK506) groups. hDPSCs at a concentration of 1106cells/rat were injected at the crush site immediate after injury. FK506 was administered intraperitoneally for7days (0.5mg/kg/day). Cell tracking with PKH26-labeled hDPSCs, Sciatic Function Index (SFI), histomorphometric study (axon count and density), retrograde labeling and RT-PCR were carried out to examine nerve regeneration effect of each treatment. Results PEMF delivered groups (15G and 30G) showed progressive improvement in SFI, which was more pronounced during the second and third weeks, especially in the 15G2W PEMF group. The SFI of the PEMF groups was higher than that of the the crush injury only group at every interval, with significantly higher values in both the 15G2W and 30G2W groups. The PEMF and PEMF + hDPSCs + FK506 groups showed a sharp increase in SFI at 2 weeks (p < 0.05). In a histomorphometric study, the 15G experimental group showed a slight increase in axon count and density compared with the control and 30G experimental groups. There were higher axon counts and densities in the PEMF + FK506 and PEMF + hDPSCs + FK506 groups compared with the control and PEMF + hDPSCs group (p < 0.05). Conclusions Exposure to 15G PEMF during early stage (0-2 weeks) after the nerve damage seemed to have more practical significance compared with 15G with longer exposure (4 weeks), or 30G with shorter (2 weeks) or longer exposure (4 weeks). PEMF with hDPSCs and FK506 showed a co-treatment effect on accelerating rat sciatic nerve regeneration, while PEMF with hDPSCs did not show a significant improvement effect in histomorphometric feature. In conclusion, 15G PEMF co-treated with hDPSCs and FK506 during early stage of damage can be an effective potential treatment for the nerve regeneration of crush-injured peripheral nerve.