페닐보론산으로 개질된 메틸셀룰로오스-폴리에틸렌이민 공중합체의 합성 및 약물·유전자 동시전달시스템으로서의 특성 분석

Abstract

본 연구에서는 메틸셀룰로오스(Methyl cellulose, MC)-폴리에틸렌이민(Polyethylenimine, PEI) 공중합체 주쇄 고분자에 페닐보론산을 도입한 약물·유전자 동시전달시스템을 개발하였다. 우선 MC를 산화시킨 후 분자량 2000 Da의 PEI를 접합시켜 주쇄 고분자인 MCPEI2k를 합성하고, 페닐보론산(Phenylboronic acid, PBA)을 도입시켜 양친매성을 갖는 MCPEI-PBA를 합성하였다. 1H NMR을 통해 MCPEI2k는 9.87개의 글루코사민 단위체당 1개의 PEI 분자가 부착되었음을, MCPEI-PBA에서는 PEI 한 분자 당 3.6개의 PBA가 붙었음을 확인하였다. PBA의 형광소광현상을 통해 PBA와 PEI 간에 B-N 결합이 존재함을 확인하였고, 이를 통해 고분자의 입자 형성 가능성을 확인하였다. 실제로 파이렌 흡광법을 통해 7.43×10-2 ㎎/㎖의 임계응집농도를 계산했고, 동적광산란계 및 투과전자현미경을 통해 입자 크기와 형태를 확인했다. 이후 pDNA와의 폴리플렉스 형성 능력을 확인하기 위해 아가로스 겔 전기영동 실험을 진행하였고, MCPEI-PBA는 무게비 1 이상에서 완전한 폴리플렉스를 형성하였다. 동적광산란계를 통해 200 ㎚ 이하의 크기와 약 20-60 mV 사이의 표면전하를 갖는 폴렉플렉스임을 확인하였다. MCPEI-PBA의 세포독성을 확인하기 위해 MTT 실험을 진행하였고, 실험에 사용한 모든 세포에서 분자량 25000 Da의 PEI인 PEI25k 보다 독성이 낮음을 확인했다. 하지만 간암세포의 한 종류인 HepG2 세포에서 유독 독성이 높은 것을 통해 이 세포와 특이적인 상호작용을 하고 있음을 알 수 있었다. 또한 트랜스펙션(transfection) 효율 평가 실험을 통해 PEI25k와 MCPEI2k에 비해 우수한 전달 효율을 가지고 있음을 확인하였고 그 정도가 HepG2에서 특히나 큰 것을 다시금 알 수 있었다. 이후 트랜스펙션 효율 평가 실험, 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein, GFP) 발현 실험, 세포 투과율 평가 실험에서 갈락토오스 전처리 과정을 추가함으로써 MCPEI-PBA와 HepG2 세포의 아시알로당단백질 수용체(Asialoglycoprotein receptor, ASGPR) 간의 상호작용이 있음을 확인할 수 있었다. 그 다음 MCPEI-PBA의 입자 내부에 독소루비신(Doxorubicin, DOX)을 담지하였다. 담지된 약물의 양은 DLE(Drug Loading Efficiency) 100.3%, DLC(Drug Loading Content) 8.8%로 계산되었다. 수용액상에서 DOX가 담지된 MCPEI-PBA/DOX와 pDNA를 복합화 시킨 MCPEI-PBA/DOX/pDNA 폴리플렉스는 각각 287 ㎚, 259 ㎚의 입자를 가졌다. pDNA 복합화를 통해 나노입자가 보다 조밀하고 균일하게 형성되었다. 또한 모두 양전하를 띠는 것을 확인함을 통해, 효과적으로 세포내로 침투 가능한 조건을 갖는 것을 예상할 수 있었다. DOX 전달을 통한 암세포 사멸효과를 확인하고자 MTT 실험을 진행한 결과, 내부에 담지된 DOX 농도가 10 ㎍/㎖ 이상일 때 같은 양의 DOX를 단독 처리 했을 때에 비해 MCPEI-PBA/DOX의 암세포 사멸효과가 높게 나타났다. 또한 세포 투과율 평과를 통해서 MCPEI-PBA/DOX가 세포 내로 효율적으로 전달되고 있음을 확인했다. 끝으로 세포자멸을 일으키는 유전자인 pJDK-apoptin을 함께 전달시켜 약물·유전자 동시전달의 가능성을 살펴보았다. DOX나 pJDK-apoptin 중 단일 물질만 전달시킨 경우보다 둘을 동시에 전달시킨 MCPEI-PBA/DOX/pJDK-apoptin에서 세포가 가장 잘 죽는 것으로 나타나, 최종적으로 MCPEI-PBA 합성 고분자의 아시알로당단백질 수용체를 통한 HepG2 세포로의 우수한 약물·유전자 전달시스템으로서의 가능성을 보였다.