Purification and Characterization of Lipoxygenase from Jinuni Bean (Rhynchosia volubilis)

Abstract

식물체 내에서 지질산화 반응에 관여하는 대표적인 효소인 lipoxygenases(LOXs)는 식물체의 성장 및 외부 스트레스에 대한 방어물질을 생성하지만, 식품공학적 측면에서는 색을 변질 시키고 이미•이취 유발 및 관련 영양성분을 산화시킴으로써 유통 및 저장기간을 단축시키는 부정적인 요인으로 작용하는 것으로 알려져 있다. 곡류, 서류, 콩류, 견과류, 과실류, 채소류 및 버섯류 등에 존재하는 LOXs의 특성 조사를 통하여 상대적으로 활성이 높고, 다량의 생리활성 성분을 함유하고 있는 쥐눈이콩(서목태)을 선정하여 부정적인 요인을 제어하기 위한 기초 연구로써, LOXs를 분리⦁정제하여 그 특성을 규명하고자 하였다. 또한, 본 연구에서는 LOX의 활성측정은 역미셀계 내에서의 새로운 분석법을 도입함으로써, 빠르고 간편하게 효소의 활성을 측정할 수 있도록 하였다. 쥐눈이콩으로부터 LOX을 황산 암모늄 분획(20-60%), DEAE-Sepharose와 ANX-sepharose ion exchange chromatography, sephacryl S-100 gel permeation chromatography을 이용하여 정제한 결과 3.47%의 수율 및 13.07의 정제도를 나타냈다. 정제된 LOX의 분자량은 SDS-PAGE 및 gel permeation chromatography를 통하여 약 66 KDa으로 판명되었다. Linoleic acid를 기질로 사용하였을 때, 최적의 반응조건은 각각 pH 8.0, 온도 15℃로 확인되었으며, pH 4.0-9.0 및 50℃이하에서 효소의 안정성이 높은 것으로 나타났다. 쥐눈이콩 유래 정제된 LOX는 13번 위치에 hydroperoxy 유도체를 생성하는 13-LOX로 판명되었으며, 정제된 LOX 단백질의 2차 구조는 α-helix (26.2%), antiparallel β-sheet (17.6%), parallel β-sheet (9.9%), β-turn (18.5%) 그리고random coil (35.4%)의 구조 등을 이루고 있는 것을 circular dichroism (CD)를 통해 확인하였다. 효소의 동력학적 상수를 분석한 결과 Vmax, Km, kcat, kcat/Km 값은 각각 22.07 μmolmin-1mg-1, 11.80 mM, 24.18 s-1, 2.05 s-1mM-1으로 나타났다. 이러한 결과를 바탕으로 쥐눈이콩 유래 LOX의 활성을 저해 할 수 있는 저해제 탐색을 통하여 식품가공적 측면에서의 부정적인 요인을 제어할 수 있을 것으로 사료된다.

In this study, for the determination of lipoxygenase (LOX) activity, the possibility of reversed micelles, widely used as an enzyme reactor for lipases, was investigated. Although it is rapid and simple, reversed micelles have some limitations, such as interference by UV-absorbing materials and surfactant. LOX activity in the reversed micelles was determined by reading the absorbance of the lipid hydroperoxidation product (conjugated diene) at 234 nm. Among surfactants and organic media, AOT and isooctane were most effective for the dioxygenation of linoleic acid in reversed micelles. The strong absorbance of AOT in the UV region is a major obstacle for the direct application of the AOT/isooctane reversed micelles to LOX assay. To prevent interference by AOT, an AOT removal step was inserted to the procedure for LOX activity determination in reversed micelles. The LOX activity was dependent on water content, and maximum activity was obtained at an R-value of 10. LOX from Jinuni bean (Rhynchosia volubilis) was purified 13.07-fold by 20-60% saturation of ammonium sulfate fractionation, ion-exchange chromatography on DEAE-sepharose and ANX-sepharose and gel permeation chromatography on sephacryl S-100. The purified LOX showed a monomeric structure with a molecular weight of 66 kDa and the pH and temperature for optimum activity were pH 8.0 and 15°C, respectively. The LOX from Jinuni bean was stable at pH 4.0-9.0 when stored at 4°C for 1 day and below 50°C when stored at pH 7.0 for 30 min. Among the substrate specificity tested, α-linoleic acid (18:2) showed the highest relative activity. When LOX from Jinuni bean reacted with α-linoleic acid, the main product was 13(S)-hydroperoxy-9,11-octadecadienoic acid (13(S)-HPOD). Far-UV circular dichroism revealed that the secondary structures of LOX consist of α-helix (26.2%), antiparallel β-sheet (17.6%), parallel β-sheet (9.9%), β-turn (18.5%) and random coil (35.4%). The kinetic parameters of LOX, Vmax, Km, kcat and kcat/Km, values were 22.07 μmolmin-1mg-1, 11.80 mM, 24.18 s-1, and 2.05 s-1mM-1, respectively.

Keywords: lipoxygenase

reversed micelles, AOT

Jinuni bean

circular dichroism