Production of recombinant human growth hormone with a transcytotic peptide in Pichia pastoris and its functional validation via oral administration

Abstract

최근 생명공학의 비약적인 발전으로 다양한 단백질 약물이 개발되고, 또 사용되고 있다. 하지만 이를 투여하는 방식에 있어서는 기존의 주사 방식에서 크게 진보하지 못하고 있는 실정이다. 주사 방식의 단백질 약물 투여는 환자나 대상 동물에게 있어 매우 번거로운 투여 방식이다. 이러한 단백질 약물의 이용성을 증진시키기 위해서는 좀 더 편리한 방법이 필요하다. 하나의 대안으로 제시할 수 있는 약물의 경구 투여 방식은 약물을 체내로 전달하는 데 있어 가장 간단하고 고통이 없는 방법 중 하나이다. 하지만 경구 투여의 경우 소화기 내에서 흡수가 제대로 이루어지지 않아 그 효율이 떨어지는 것이 단점이다. 이러한 문제점은 소장의 물리적 장벽, 즉 소장의 상피층 때문에 발생한다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 본 실험실에서는 파지 디스플레이 기법 (Phage display technique)을 이용해 소장 흡수 촉진 펩타이드인 TP1을 선발하였다. 이 펩타이드는 아미노산 9개 (CSKSSDYQC)로 구성되었으며, 소장 상피층에 존재하는 배상세포 (Goblet cell)의 특정 막 수용체 (Membrane receptor)에 결합하여 수용체 매개 물질운송 기전 (Receptor-mediated endocytosis)을 통해 흡수된다. 본 연구는 단백질 약물 전달에 있어서의 TP1의 효과를 검증하기 위해 진행되었으며, 이를 위해 융합 약물 (Conjugated drug)을 고안하였다. 이 융합 약물은 소장에서의 흡수를 도와주는 TP1과 단백질 약물이 결합된 형태를 가진다. 본 연구에서 TP1과 결합된 단백질 약물로써 이용된 모델 약물은 인간 성장 호르몬 (Human growth hormone)이다. 이 융합 약물은 대량 생산을 위해 Pichia pastoris에서 생산되었다. 이를 위해 Pichia pastoris 특이적인 벡터 (Vector)를 구축하였으며, 이를 P. pastoris에 형질전환 (Transformation)하였다. 또한 P. pastoris 배양액으로 분비되는 융합 약물의 회수를 위해 소수성 상호작용 크로마토그래피 (Hydrophobic interaction chromatography)를 이용하여 정제를 실시하였다. 생산 및 정제에서 최적화 과정을 거친 뒤 생산된 재조합 단백질의 양은 평균 0.79 g/L 으로, 산업적으로 P. pastoris가 이용될 때 (1 g/L) 와 유사한 수준까지 도달하였다. 생산된 융합 약물의 기능을 평가하기 위해 다양한 실험이 진행되었다. 인간 간암 세포주인 HepG2를 이용하여 융합 약물이 인간 성장 호르몬 고유의 성장 촉진 기능인 인슐린양 성장인자 (insulin-like growth factor-1, IGF-1)의 분비를 유도하는 것을 확인하였다. 생체 내 (In vivo) 실험에서는 총 세 가지의 실험이 진행되었다. 첫 번째로는 면역조직화학법 (Immunohistochemistry)를 통해 TP1이 결합된 융합 약물이 인간 성장 호르몬만 단독으로 처리된 경우보다 소장 상피층의 융모 (Villi)에 흡수가 잘 이루어진다는 것을 확인하였으며, 두 번째로는 융합 약물이 간에서 인슐린양 성장인자 분비량을 증가시키는 것을 확인하였다. 세 번째는 융합 약물의 최종 기능 평가로써 본 재조합 약물의 성장 촉진 효과를 증체량 측정을 통해 확인하였다. 또한 실험 과정 중에 TP1이 인간 성장 호르몬의 아미노 말단 (N-terminus)에 결합된 경우에는 TP1의 소장 흡수 촉진 기능이 소실되며, 인간 성장 호르몬의 카복실 말단 (C-terminus)에 결합된 경우에만 TP1이 제대로 작동한다는 것을 확인하였다. 위와 같은 일련의 실험을 통하여 TP1이 단백질 약물과 융합된 상태로 약물의 소장 흡수를 촉진한다는 사실을 규명하였다. 이러한 단백질 약물의 효과적인 경구 투여 방법은 인간과 가축을 비롯한 동물에 있어 치료제, 백신, 건강 보조제 등 다양한 분야에 있어 단백질 약물의 이용성을 증진시킬 것으로 기대된다.

Among the drug delivery methods, oral administration is a simple and painless method. However, oral delivery of protein drugs has defects in their application. Low absorption rate in the gastrointestinal tract (GIT) caused by the physical barriers of intestinal epithelia is the most difficult challenge to overcome. Transcytotic ligand TP1 was found in our laboratory through peroral phage display technique, which was characterized as having a transcytotic property to traverse intestinal epithelia by targeting goblet cells. We demonstrated that TP1 enhanced the efficiency of protein drug delivery via oral route as a form of Conjugated drug. We generated a model drug which was composed with TP1 and human growth hormone (hGH) by genetic recombination. The conjugated drug was produced from Pichia pastoris as a mass-production system and purified by hydrophobic interaction chromatography (HIC). The function of this recombinant protein drug were validated by in vitro and in vivo assays. This recombinant drug showed transcytotic property to intestinal epithelia as well as revealed its own activity as growth hormone. And it increased growth performance in tested animals compared to non-treated group. We also found that only TP1 introduced in C-terminus of hGH could maintain its transcytotic property as an oral drug. The present study opens up the possibility for the establishment of an effective oral drug delivery system using transcytotic peptide, TP1, could be applied in the pharmaceutics and animal industry fields to improve availability of protein drugs via oral route.