수용성 RANKL을 발현하는 유산균 경구백신 면역증강제 개발

Abstract

경구백신은 주사로 인한 스트레스가 적다는 장점 뿐 아니라 병원균을 초도에 방어할 수 있다는 장점이 있다. 경구백신을 통해 점막면역반응이 활성화 되면, 분비형 항체인 IgA가 소장 내강에서 병원균을 무력화시키기 때문에, 병원균이 소장 상피세포를 통과하여 체내로 들어오지 못하게 막아주기 때문이다. 그러나 경구백신의 경우 주사형 백신에 비해 효율성이 매우 약하다는 단점이 있다. 따라서 경구백신의 효율성을 증진시키기 위한 면역증강제를 개발하는 것은 매우 중요하다고 할 수 있다. 소장에 유입된 항원이 체 내의 dendritic cell을 만나기 위해서는 소장 상피세포를 통과해야 한다. 이 때 외부 항원을 통과시켜주는 역할을 하는 세포가 M cell이다. 따라서 본 연구는 M cell의 기능을 활성화 시킬 수 있다면 경구백신의 효율성을 증진시킬 수 있을 것이라는 가설에서 시작되었다. RANKL은 TNF cytokine 중 하나로 파골세포의 기능을 활성화 시키는 데 매우 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 최근들어 RANKL은 peyer's patch 발달에 꼭 필요할 뿐 아니라 M cell 분화를 유도하는 인자라는 연구가 보고된 바 있다. 따라서 본 연구는 soluble RANKL을 분비 및 발현하는 L.lactis를 구축하고 재조합 유산균이 경구백신의 면역증강제로서의 가능성을 검정하였다. 우선 mouse sRANKL의 서열을 발현 숙주인 L.lactis에 맞춰 코돈최적화를 진행하였다. PCR과 제한효소 Nde1, Xho1을 이용하여 pIL252 벡터에 sRANKL 유전자를 삽입하고 electroporation을 통해 유산균에 벡터를 도입한 후, colony PCR과 sequencing을 통해 재조합 유산균을 선택하였다. Western blot을 통해 재조합 유산균에서 sRANKL이 발현된다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 쥐의 대식세포주인 RAW 264.7 cell이 RANKL과 M-CSF가 존재하는 환경에서 osteoclast-like cell로 분화한다는 특성을 이용하여 재조합 유산균에서 발현된 sRANKL의 생물학적 활성을 검정하였다. 재조합유산균의 경구 백신 면역증강제로서의 가능성을 검정하기 위해 BALB/c mouse를 이용하여 in vivo 면역실험을 실시하였다. 1주일간 Mouse에 PBS 혹은 재조합 유산균주를 매일 한번씩 경구투여하고, 실험실에서 보유하고 있는 돼지적리균의 막 단백질 아단위 백신에 M cell 표적 펩타이드가 conjugation한 형태의 M-BmpB를 경구투여하였다. M-BmpB 2차 boosting 한지 1주일과 2주일이 지났을 때 mouse의 혈액과 분을 채취하여 M-BmpB 특이적인 IgG와 IgA의 양을 살펴보았다. 결과적으로 대조군에 비해 재조합유산균을 경구투여한 그룹에서 M-BmpB 특이적인 IgG와 IgA가 증가하는 양상을 보였기에 재조합유산균을 경구백신의 면역증강제로서의 가능성을 확인하였다.