Genome and Transcriptome Analyses of Vibrio vulnificus FORC_036 Isolated from a Surf Clam

Abstract

패혈증 비브리오균은 그람음성 간균으로 해양에 서식하는 식중독균이다. 이는 가벼운 위장질환에서부터 사망률이 50%에 달하는 패혈증을 야기한다. 해산물을 날 것으로 섭취하거나 오염된 해수에 상처부위가 노출되면 감염이 발생한다. 동죽에서 분리한 패혈증 비브리오균의 독성을 PCR과 세포주 실험을 통해 확인하고 FORC_036으로 명명하였다. FORC_036의 특성을 알아보기 위해서 유전체와 전사체 분석을 진행하였다. FORC_036은 두 개의 염색체와 하나의 플라스미드를 가지고 있었으며, 5,642개의 전사해석틀, 203개의 운반 RNA와 34개의 리보솜 RNA가 지니고 있다고 예측된다. FORC_036은 주요 독성인자는 물론 병원성에 기여하는 다양한 유전자들을 가지고 있었다. 비브리오 속의 16S 리보솜 RNA를 이용한 계통 분석을 통해서 FORC_036이 패혈증 비브리오균에 속한다는 것을 다시 확인하였다. 더불어, 유전체 분석이 완료된 5개의 패혈증 비브리오균과의 종 간 유사도를 확인한 결과, FORC_036은 환자로부터 분리한 CMCP6와 계통학적으로 가장 유사하였다. FORC_036과 CMCP6의 유전체 비교 분석을 통해 FORC_036이 fucose 대사 유전자와 thermostable hemolysin delta-VPH 유전자를 추가적으로 가지고 있음을 확인하였다. 국내에서 날 것으로 섭취한 후, 패혈증을 일으킨 사례가 있는 낙지를 모델 식품으로 선정하여 FORC_036가 낙지에 노출되었을 때의 유전자 발현양상 변화를 RNA sequencing 기법을 이용해 확인하였다. 운동성과 관련된 유전자는 발현이 감소한 반면, 부착, 유당 대사, 철 흡수와 관련된 유전자의 발현은 증가하였다. 하지만 독성 관련 유전자의 발현은 큰 변화를 나타내지 않았다. 결론적으로, 동죽에서 분리한 패혈증 비브리오균 FORC_036은 여러 독성인자를 가지고 있어 병원성을 나타낼 가능성이 높고, 모델 식품인 낙지에 노출되면 낙지를 하나의 저장소로 인지하고 생존과 성장을 유지할 것으로 예측된다. 본 연구를 통해 국내 식중독균에 대한 데이터베이스를 축적하고 이 후에 발생하는 패혈증 비브리오균에 의한 질병 발생을 효율적으로 처리할 수 있을 것으로 기대된다.

Vibrio vulnificus is a Gram-negative, curved rod-shaped marine pathogen that causes from the gastrointestinal diseases to the primary septicemia whose mortality rate is approximately 50%. Its infection happens through the consumption of raw seafood or exposure of wound to contaminated seawater. To characterize V. vulnificus that isolated from a surf clam, the genome and transcriptome of this strain were analyzed. Virulence gene-specific polymerase chain reaction (PCR) screening and lactate dehydrogenase (LDH) release assay were conducted to evaluate the virulence of this strain. It showed a high level of cytotoxicity which was similar to cytotoxicity of V. vulnificus MO6-24/O, a clinical isolate and had many virulence genes. So, it was called as FORC_036 and further analyzed. The genome of the strain FORC_036 consisted of three conitgs

two chromosomes and one plasmid. Its genome was predicted to have 5,642 open reading frames (ORFs), 203 tRNA (transfer RNA) genes and 34 rRNA (ribosomal RNA) genes. Also, V. vulnificus FORC_036 had a plenty of virulence genes including toxins encoding genes, secretion systems related genes, and iron uptake systems related genes. The phylogenetic analysis using 16S rRNA from Vibrio species was demonstrated the strain FORC_036 was grouped with other V. vulnificus strains. And the average nucleotide identity (ANI) analysis using the complete genome of V. vulnificus strains showed that a clinical isolates, CMCP6 was the closest strain to the strain FORC_036. The comparative genome analysis with V. vulnificus CMCP6 suggested that V. vulnificus FORC_036 had additional genes

(1) L-fucose utilization related genes and (2) thermostable hemolysin VPH-delta encoding gene. To figure out the transcriptional response when the strain FORC_036 was exposed to the model food (small octopus), RNA sequencing was conducted. The result showed that the expression of the motility related genes was down-regulated and the genes related to the adherence, galactose metabolism, and iron uptake were up-regulated. However, the expression of the toxin related genes was remained. Therefore, the strain FORC_036 recognized the small octopus as a reservoir rather than the host. All results described above demonstrated that V. vulnificus FORC_036 isolated from a surf clam was possibly pathogenic to human and used the small octopus as a reservoir to survive and grow. Through this study, the information of the pathogen isolated from environment was accumulated and it helps to deal with V. vulnificus-related outbreaks.