Synthesis of Milk Protein-derived Oligopeptides and Their Effect on Melanogenesis

Abstract

우유는 오래전부터 그 특유의 색깔 때문에 미백 기능을 가지는 것으로 막연히 여겨왔고, 클레오파트라를 비롯한 역사 속 미인들이 우유로 세안과 목욕을 했다고 전해지고 있다. 1990년대에 들어 유청에서 분리한 단백질 중 κ-casein과 β-lactoglobulin이 멜라닌 생합성을 효과적으로 저해한다는 논문이 발표된 바 있고, 2000년대에는 분리된 유청 단백질의 아미노산 서열을 분석하는 연구가 활발히 이루어지면서, 펩타이드 조각에 대한 연구와 동시에 이들의 항산화 기능이 밝혀졌다. 이에 본 연구에서는 미백 기능과 항산화 기능 모두를 갖는 우유 단백질 유래 펩타이드의 개발을 목적으로 하여, 기존의 항산화 기능만 보고된 우유 유래 펩타이드 중 네 가지(Tyr-Phe-Tyr-Pro-Glu-Leu, Met-His-Ile-Arg-Leu, Tyr-Val-Glu-Glu-Leu, Trp-Tyr-Ser-Leu-Ala-Met-Ala-Ala)를 선정하였다. 또한, 펩타이드의 구조 중 미백 활성을 나타내는 부분을 찾고, 짧지만 강한 활성을 가지는 펩타이드를 찾기 위해 네 가지의 아미노산을 포함하는 펩타이드 조각들을 디자인 및 합성하였다. 모든 합성은 Fmoc 화학법에 의한 고체상 펩타이드 합성을 통해 이루어졌다. 버섯의 타이로시나아제를 이용한 실험을 통해 우유 단백질 유래 펩타이드의 타이로시나아제 억제활성을 측정하였다. 그리고, 몇 가지의 펩타이드 조각이 본래 펩타이드보다 좋은 활성을 보이는 것을 확인하였다. 또한, 다양한 농도에서 활성을 측정함으로써 각 펩타이드의 IC50을 계산하였다. 또한, 가장 낮은 IC50을 보인 펩타이드의 유도체들을 디자인하여 펩타이드가 타이로시나아제를 억제하는 과정에 관여하는 요소에 대한 연구를 통해 아르기닌의 양전하가 중요한 역할을 하는 것을 발견 하였다. 높은 타이로시나아제 억제 활성을 보인 MHIRL과 그 유도체들(MHIR, HIRL)을 선정하여 그 활성을 세포에서도 확인하였다. B16F10 세포와 Mel-Ab 세포에 이들 펩타이드를 처리한 결과, MHIRL 유도체가 두가지 종류의 멜라닌 세포에서 독성이 없이, 일반적인 미백제로 사용되는 알부틴보다 좋은 멜라닌 생합성 저해 활성을 보이는 것을 확인하였다.

Milk is generally considered to make skin milky-white because of its unique color. Milk protein such as κ-casein and β-lactoglobulin has been reported to suppress melanogenesis in cultured human melanocytes, and peptides derived from the aforementioned proteins were recently isolated and their antioxidant activity was studied. For these reasons, we expected that milk protein-derived peptides could have both antioxidant and tyrosinase inhibitory acitivity. We selected four kinds peptides derived from milk protein (Tyr-Phe-Tyr-Pro-Glu-Leu, Met-His-Ile-Arg-Leu, Tyr-Val-Glu-Glu-Leu, Trp-Tyr-Ser-Leu-Ala-Met-Ala-Ala) and screened peptide fragments containing four amino acids to find the active part of the peptide or shorter peptide with strong activity. All of the peptides were prepared by solid-phase peptide synthesis using an Fmoc strategy, and characterized by RP-HPLC and ESI-MS. Rink amide AM resin was chosen as a solid support. Tyrosinase inhibitory activities of milk protein-derived peptides were evaluated by mushroom tyrosinase inhibition assay. We found that some of the tetrapeptides showed superior activities compared to the original peptide, though others had reduced tyrosinase inhibitory activity. The IC50 values of the peptides were also calculated by measuring tyrosinase inhibitory activities at different concentrations. In the mushroom tyrosinase inhibition assay system, MHIRL and its fragments sufficiently inhibited tyrosinase, and exhibited the lower IC50 values. Therefore, we designed other derivatives by replacing an amino acid from their sequences. The tyrosinase inhibitory activities of these derivatives were also measured. In addition, we found that the positive charge of arginine was crucial for their tyrosinase inhibitory activity. MHIRL derivatives were tested for cytotoxicty and anti-melanogenesis activity in B16F10 cells and Mel-Ab cells. All of the peptides did not affect cell viability, and suppressed melanogenesis sufficiently in B16F10 cells. From these studies, we found that MHIRL derivatives could act as good tyrosinase inhibitors as well as antioxidants. We believe that these peptides could be applied in the fields of cosmetics, medicine, and in the agriculture industry.