30Kc19 단백질과 융합을 통한 백혈병치료제 L-asparaginase의 안정화 및 적혈구로의 인캡슐레이션

Abstract

L-asparaginase (ASNase) from E. coli is one of the therapeutic enzymes of acute lymphoblastic leukemia (ALL). However, problems arise from direct injection of ASNase due to its short half-life and cause of immune response. Hence, to avoid these problems, loading ASNase into red blood cells (RBC) has been a popular method. In previous studies, we reported that the 30Kc19 protein from Bombyx mori enhanced enzyme stability. Moreover, we reported that the 30Kc19 protein has cell-penetrating property. In this work, we constructed pET-23a/ASNase-30Kc19 vector and overexpressed the ASNase-30Kc19 fusion protein in E. coli system. We purified the fusion protein by using fast protein liquid chromatography, and investigated the suppression of ASNases deactivation. By using spectrofluorometer, FACS (flow cytometer) and CLSM (confocal laser scanning microscopy), we investigated that Alexa Fluor ®-488 labeled ASNase-30Kc19 was successfully loaded into the RBC. Surface morphology by scanning electron microscopy of the RBCs loaded with ASNase-30Kc19 also revealed that it was similar to that of the normal RBCs. Here, we demonstrated that by fusion with 30Kc19 cell-penetrating protein, the stability of ASNase was maintained and it also penetrated into RBCs successfully. Also, we verified the activity of ASNase-30Kc19-loaded RBCs compared with the therapeutic enzyme. To test the feasibility for the preliminary in vivo experiment, ASNase-30Kc19-loaded RBCs will be tested in mouse model.

E. coli K-12유래의 L-asparaginase(ASNase)는 급성 림프구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia, ALL)의 치료제 중 하나로 이용되고 있다. 하지만 ASNase는 혈중반감기가 짧고, 주사 시에 면역반응이 발생한다는 문제점을 지닌다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 ASNase를 적혈구상에 적재한 연구들이 수행되어 왔다. 이전 연구에서 본 그룹은 누에 유래의 30Kc19단백질에 효소의 안정성을 향상시킨다는 효과가 있고, 또한 30Kc19 단백질이 세포투과성을 지닌다고 보고한 바가 있다. 본 연구에서는 pET-23a/ASNase-30Kc19 vector를 구축하고, 이를 통해 ASNase-30Kc19 융합단백질을 E. coli 상에서 과발현하고, 고속액체크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 그리고 30Kc19단백질의 융합을 통해 ASNase 활성 감소를 억제하는 지를 조사하였고, 분광형광계, 유세포 측정기와 공초점 현미경을 통해 Alexa Fluor®-488 형광염료로 표식된 ASNase-30Kc19 단백질이 성공적으로 적혈구에 적재되는지를 확인하였다. 주사전자현미경을 통해 ASNase-30Kc19 단백질이 적재된 적혈구의 표면의 모양을 관찰한 결과 정상 적혈구의 모양과 유사한지를 조사하였고 이를 통해 적재하는 과정에서 적혈구에 어떠한 손상을 나타내지 않았음을 확인하였다. 본 연구에서 세포투과성의 30Kc19 단백질과의 융합을 통해 ASNase를 안정화시킬 수 있었고, 적혈구 내로 투과시킬 수 있었다. 또한 ASNase-30Kc19 단백질이 들어간 적혈구에서도 치료용 효소의 활성을 나타내고, 백혈병 cell line을 대상으로 항암효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 향후 예비 in vivo 실험으로 쥐 모델에서 ASNase-30Kc19 단백질이 들어간 적혈구의 백혈병 치료제로 적용 가능성을 확인할 예정이다.