마커 유전자 조합을 이용한 비결핵 마이코박테리아 동정 및 분류 시스템 연구

Abstract

인간이 살아가는 환경에는 수많은 균들이 존재하고 인간에게 유익한 균도 있고 해가 되는 균도 있다. 그 중에서 비결핵 마이코박테리아균은 마이코박테리아 속(genus)에서 결핵균과 나병균을 제외한 균을 말한다. 비결핵 마이코박테리아는 결핵균과 구분 없이 인식되다가 1980년대 AIDS의 확산과 함께 크게 확산된 박테리아균이다. 자연계에 감염보유 숙주가 없는 결핵균과는 달리 비결핵 마이코박테리아는 물과 토양이 있는 주변 환경에서 발견된다. 비결핵 마이코박테리아는 주로 호흡기, 경부 림프선, 피부 등에 감염을 일으키며, 이 균에 의한 질환 중 90% 이상이 호흡기 질환이다. 림프절염은 주로 Mycobacterium avium complex(MAC), M. scrofulaceum에 의해 발병하고 M. szulgai, M. marinum, M. ulcerans, M. vaccae은 피부 감염을 일으킨다. MAC, M. kansasii, M. scrofulaceum, M. xenopi등은 파종성 질환의 원인균으로 밝혀졌다. M. non-chromogenicum, M. kansasii는 관절 및 점액낭 감염을 일으키고 M. paratuberculosis는 크론병을 일으킨다. 오랜 세월 인간을 괴롭혀온 결핵균은 예방 및 치료에 대한 연구가 많이 시행되어 발병률이 낮아진 반면, 비결핵 마이코박테리아는 다양한 국가의 도시, 농촌 지역에서 새로운 종이 발견되며 점차 증가하고 있는 추세이다. 근래에는 결핵균 발병률과 비슷한 수준에 이르고 있다. NTM균은 100여종이 발견되었는데 그 중에서 우리나라에서 가장 흔하게 나타나는 균은 Mycobacterium avium complex로 대략 60~80%를 차지한다. M. abscessus균은 외국에서는 드물게 발견되지만 한국에서는 두 번째로 흔한 NTM균이다. 반면 미국과 일본에서 두 번째로 흔한 M. kansasii 폐질환은 국내에서는 상대적으로 발생 빈도가 낮다. 결핵균과 비결핵균 감염을 확인하는 방법은 항산균도말검사, 배양검사, 핵산증폭검사가 있다. 하지만 진단 기간이 수개월에서 수년이 걸리기도 하고 결핵균과 비결핵 마이코박테리아균을 오진하는 경우가 많기 때문에 치료와 진단에 어려움이 있다. 이에 생물정보학적 기술을 이용한 동정이 필요한 실정이다. 최근에는 마커 유전자들을 이용한 종 동정이 다양한 연구에 활용되고 있다. 이는 단일 마커 유전자에 의한 동정보다 정확하고 견고한 것으로 밝혀진 바 있다. 이에 본 연구에서는 비결핵 마이코박테리아 종과 마커 유전자에 대한 서열 정보를 검색하고 마커 유전자 분석에 활용할 수 있는 웹 서버 기반의 데이터베이스를 구축하고자 한다. 이를 이용한 다양한 마커 유전자 서열 조합은 보다 정확한 종 동정으로 이어질 것으로 기대된다. 본 연구의 데이터베이스는 44종의 비결핵 마이코박테리아균 종과 5개의 마커유전자인 16S rRNA, hsp65, rpoB, sodA, tuf에 대한 서열 정보를 효율적으로 검색하고 활용할 수 있도록 하였다. 16S rRNA와 hsp65는 NTM의 가장 대표적인 유전자 마커로 16S rRNA는 모든 원핵 생물이 갖고 있는 유전자이고, hsp65는 생물의 면역력을 발생시키는 마이코박테리아균의 항원 단백질이다. rpoB는 박테리아의 RNA polymerase의 β-subunit 유전정보를 가진 마커 유전자이고, Superoxide dismutase(SOD)는 세포에 해로운 독성을 제거해주는 효소이다. tuf 유전자는 elongation factor EF-Tu의 발현을 담당하는데 그람음성 세균(gram negative bacteria) 종들에게서 tuf 유전자의 중복이 발견됨에 따라 박테리아 유전자 분석의 마커 유전자로 이용되고 있다. 기존 연구에서 밝혀진 44종의 비결핵 마이코박테리아 종에 대한 정보를 GenBank의 ftp gbbct 파일에서 JAVA 언어로 추출하여 MySQL 데이터베이스와 fasta 형식의 파일로 저장하였다. 이러한 데이터를 HTML, javascript, JSP 프로그래밍 언어로 가공하여 apache-tomcat 웹 서버와 연동시켰다. 또한 ClustalX, MEGA, SequenceMatrix, WWWBlast 프로그램을 활용하여 상동성 분석, 서열 정렬 및 조합을 통한 계통수 분석을 수행하였다. 연구 결과 16S rRNA-hsp65-rpoB-sodA-tuf의 5개 마커 유전자 조합에 의한 동정법이 16S rRNA-hsp65-rpoB-sodA의 4개 마커 유전자 조합의 경우보다 p-distance 수치가 높고, bootstrap이 50이상인 node수가 많아 더욱 분별력 있고 견고한 방법이 될 수 있음을 확인하였다. 이에 본 데이터베이스와 같은 유전자 서열 정보 시스템을 이용한 다양한 마커 유전자 조합을 통해 보다 정확한 비결핵 마이코박테리아균 동정이 가능함을 증명하였다. 이를 활용한 균 동정은 비결핵 마이코박테리아뿐만 아니라 다양한 균을 대상으로 한 연구로 이어져 해당 균에 대한 예방과 치료법의 개발로 확대될 것으로 기대된다. 이는 인간의 건강 증진을 최우선시 하는 보건학적 측면에서 의미 있는 연구가 될 수 있을 것이다.