Enhancement of cholera vaccine-induced chemokine expression by short chain fatty acids in human intestinal epithelial cells

Abstract

1. 목 적

콜레라 백신은 듀코랄(DukoralTM)과 샨콜(ShancholTM)이 경구용 백신으로 승인/판매 되고 있으나, 효능 면에 있어서 장기 면역 효과가 떨어지는 점과 많은 양을 투여해야 한다는 단점이 있다. 콜레라 백신접종 초기에 백신에 의해 활성화된 장 점막 상피세포는 면역반응 유도에 필수적인 역할을 하는 면역세포들을 불러 모을 수 있는 케모카인을 발현할 수 있으며, 장내에 존재하는 미생물의 주요 대사체 중 하나인 단쇄지방산은 장 점막 상피세포의 장벽 기능 강화 등 장내 건강과 관련되어 있는 것으로 알려져 있다. 하지만, 현재까지 단쇄지방산과 점막 백신이 유도하는 면역 반응과의 관련성에 대해서는 아직 잘 알려져 있지 않다. 따라서 본 연구는 단쇄지방산이 콜레라 백신이 유도하는 장내 케모카인 발현을 조절할 수 있는지에 대해 알아보았다.

2. 방 법

인간 장 점막 상피세포주인 HT-29와 Caco-2 세포에 상용 콜레라 백신 샨콜을 처리하여 케모카인의 발현양상을 역전사효소 중합연쇄반응(RT-PCR)과 효소결합 면역분석법(ELISA)를 이용하여 확인하였다. 주요 장내 대사체 중 하나인 단쇄지방산이 콜레라 백신에 의해 유도하는 케모카인 발현에 어떠한 영향을 주는지 알아보기 위해, Caco-2 세포에 콜레라 백신 샨콜과 단쇄지방산을 동시에 처리한 후, 케모카인의 mRNA 발현량을 Realtime PCR과 ELISA를 통해 측정하였다. 실제 인체 장 상피세포에서도 동일한 경향이 나타나는 지를 확인하기 위해 인간의 장 조직에서 분리한 상피세포인 SNU-407 세포와 SNU-61 세포에 샨콜과 단쇄지방산을 복합 처리 후 케모카인의 생산을 ELISA를 통해 확인하였다. 3주 이상 분극화시킨 완전분화 장 상피세포에서도 동일한 경향이 나타나는 지 확인하기 위해 transwell 시스템을 이용하여 Caco-2 세포를 4주 이상 배양하여, 분극화되었음을 확인한 후 샨콜과 단쇄지방산을 병용 처리 한 뒤 케모카인의 분비량을 ELISA를 통해 측정하였다. 세포 내부 신호전달을 알아보기 위해 Caco-2 세포에 신호전달 관련 특이 억제제(MAPK 억제제, G 단백질 수용체 저해제, ATP 수용체 길항제)를 1시간 전처리 후 샨콜과 단쇄지방산을 병용 처리하여 분비된 케모카인의 양을 ELISA를 통해 분석하였다. 또한, 샨콜과 단쇄지방산을 병용 처리하였을 때 세포 밖으로 분비되는 ATP의 양을 측정하였으며, 단쇄지방산의 후성유전학적 신호 전달과 유사한 것으로 알려진 histone deacetylase (HDAC) 저해제를 콜레라 백신과 복합 처리한 후 케모카인의 mRNA 발현량을 관찰하였다. 마지막으로, 샨콜과 단쇄지방산 병용 처리에 의해 유도되는 미성숙 수지상세포의 이동을 transwell을 이용하여 확인하였다.

3. 결 과

Caco-2 세포에서는 샨콜에 의해 CCL2, CCL20, CXCL10, 그리고 HT-29 세포에서는 CCL5, CCL20, CXCL10의 mRNA 발현이 강하게 유도되었으나, 대부분 케모카인의 단백질 발현은 증가 되지 않았으며, CCL20과 CXCL10만 단백질 수준에서 약하게 발현됨을 확인하였다. 또한 대부분의 케모카인은 단쇄지방산에 의해 mRNA와 단백질의 생성이 증가하지 않았지만 단쇄지방산 중 butyrate는 콜레라 백신 샨콜에 의해 유도되는 CCL20의 mRNA 발현과 단백질 발현을 강하게 증가시켰다. 이 현상은 샨콜의 농도가 증가할수록, 그리고 butyrate의 농도가 증가할수록 농도 의존적으로 나타나는 현상이었고, 실제 인체 유래 장 상피세포와 4주 이상 분극화된 Caco-2 세포에서도 동일한 경향을 나타내는 것을 확인하였다. 단쇄지방산의 주요 수용체로 알려진 G-단백질 수용체의 저해제, GPR109A 길향제, 그리고 MAPK 억제제 전처리에 의해 샨콜과 butyrate 병용 처리 시 유도하는 CCL20의 발현 증가가 부분적으로 억제됨에 따라 GPR109A 수용체와 하위 신호전달인 MAPK 신호전달이 CCL20 발현 증가에 관여함을 확인하였다. 또한, butyrate와 비슷하게 HDAC 저해제로 잘 알려진 트리코스타틴 A 역시 샨콜이 유도하는 CCL20의 발현을 눈에 띄게 증가시켰으나, 다른 케모카인의 발현은 유의적으로 감소시켰다. 마지막으로 샨콜과 butyrate는 Caco-2 세포에 병용 처리 시 세포 외부로 분비되는 ATP의 양을 증가시키며, ATP 수용체 길항제를 전처리 시 CCL20 발현이 억제됨에 따라 세포 외부로 분비된 ATP가 P2X7 신호전달을 통해 CCL20 발현 증가에 관여함을 알 수 있었다. 마지막으로, 샨콜을 단독으로 처리한 배양 상층액에 비해 샨콜과 butyrate를 병용 처리한 배양 상층액을 미성숙 수지상세포에 처리 시 미성숙 수지상세포의 이동이 증가함을 확인하였다. 이를 종합해 보면, 단쇄지방산 중 butyrate는 Caco-2 세포에서 HDAC 저해와 세포 외부로 분비된 ATP-P2X7의 신호전달, 그리고 G-protein 수용체 중 GPR109A의 신호전달을 통해 콜레라 백신 샨콜이 유도하는 케모카인 중 CCL20 만을 특이적으로 강하게 증가시키며 이는 콜레라 백신이 장내에서 유도하는 점막 면역 반응을 더 증강시키는 데 관여할 것으로 예상된다.

Objectives DukoralTM and ShancholTM are currently available oral cholera vaccines, but both vaccines have some limitations in terms of vaccine efficacy such as low immunogenicity, short term protection and requirement of high doses. Oral cholera vaccines can activate intestinal epithelial cells which play a key role in the recruitment and activation of immune cells by producing chemokines. Short chain fatty acids (SCFAs) such as butyrate, acetate, and propionate have been known to modulate immune responses in the gut. However, the effect of SCFAs on the mucosal vaccine-induced immune responses has been poorly understood. The present study investigated whether SCFAs modulate the chemokine expression induced by a bivalent, killed whole cell, oral cholera vaccine, Shanchol™, in human intestinal epithelial cells.

Methods The human intestinal epithelial cells, Caco-2 and HT-29, were stimulated with inactivated Vibrio cholerae or ShancholTM. In order to examine the effect of SCFAs on Shanchol™-induced chemokine production, Caco-2 cells and primary intestinal epithelial cells were treated with Shanchol™ in the presence of acetate, butyrate, or propionate. For the polarization of Caco-2 cells, the cells were cultured for 4 weeks in a transwell system, and then, the cells were apically or basolaterally stimulated with Shanchol™ and/or butyrate. To investigate the intracellular signaling events, Caco-2 cells were pre-treated with pertussis toxin, mepenzolate bromide, SB203580, PD98059, SP600125 and oxATP, respectively, and subsequently, the cells were stimulated with Shanchol™ and/or butyrate. In addition, Caco-2 cells were stimulated with ShancholTM in the presence or absence of adenosine triphosphate (ATP) or trichostatin A (TSA). Chemokine production was determined using real-time RT-PCR and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). ATP secretion in Caco-2 cells in response to ShancholTM and/or butyrate was determined by ATP luminescence assay. After co-treatment with ShancholTM and butyrate, the migration of immature dendritic cells (DCs) was examined using a transwell system.

Results When Caco-2 and HT-29 cells were stimulated with Shanchol™, mRNA expression of several chemokines including CCL2, CCL5, CCL20 and CXCL10 substantially increased whereas the production of their proteins was negligibly induced. Interestingly, a significant increase of CCL20 secretion was observed when the cells were co-stimulated with Shanchol™ and butyrate, but neither acetate nor propionate did not produce such effect. Besides, co-treatment with Shanchol™ and butyrate up-regulated only CCL20 expression, but not other chemokines. Furthermore, butyrate increased Shanchol™-induced CCL20 production in polarized epithelial cells and primary intestinal epithelial cells. Co-treatment with Shanchol™ and butyrate increased the expression of a butyrate receptor, GPR109A whereas CCL20 induction was suppressed by a specific inhibitor of GPR109A, indicating that the induction of CCL20 secretion is associated with GPR109A activation. TSA, an histone deacetylase (HDAC) inhibitor, enhanced Shanchol™-induced CCL20 production, suggesting that HDAC inhibition is involved in CCL20 production. In addition, the co-treatment with Shanchol™ and butyrate synergistically increased ATP levels in the culture supernatant and CCL20 secretion was decreased at the blockade of extracellular ATP receptor, P2X7, implying that ATP is also involved in the synergistic production of CCL20. The number of migrated immature DCs was increased when the cells were treated with the culture supernatant of Caco-2 cells co-treated with ShancholTM and butyrate compared to that of ShancholTM-treated Caco-2 cells.

Conclusion Collectively, the present study demonstrated that one of SCFAs, butyrate potently enhanced Shanchol™-induced CCL20 production in human intestinal epithelial cells via HDAC inhibition and ATP-P2X7 signaling by activating GPR109A, potentially contributing to the enhancement of the mucosal immune responses in the gut.