헤파린 결합 기능성 합성 펩타이드에 의한 항종양 효과 연구

Abstract

1. 목 적

Bone morphogenetic protein-4 (BMP-4)는 Transforming Growth Factor-β (TGF-β) superfamily의 하위 그룹에 포함되는 다기능적 성장 인자이다. BMP-4의 주된 기능은 골형성 촉진 효과이지만, 그 외에도 근육 발생, 인간 배아의 발생, 골의 무기질화 등의 다양한 기능을 나타내므로 다양한 질환들의 임상적 치료에 활용 가치가 높을 것으로 기대된다. 최근에는 BMP-4가 다양한 종양 세포에 항종양 효과를 가진다는 연구들이 보고되었고, BMP-4를 종양 치료에 이용하려는 노력들이 시도되고 있다. 최근 연구에서 BMP-4의 heparin binding domain (HBD) peptide는 heparin과 결합하여 BMP-4의 골형성 촉진 효과에 기여한다는 것이 밝혀졌다. 또한, 다른 기능으로서 헤파린과 결합함으로써 HBD peptide는 BMP-4의 생리적 기능에 중요한 역할을 담당하는 부위로 BMP-4의 항종양 효과에도 작용할 것으로 기대된다. 본 연구에서는 BMP-4에서 도출한 HBD peptide에 의한 항종양 효과를 평가하고자 하였다.

2. 방 법

BMP-4에서 도출한 heparin binding domain (HBD) 가 종양 세포 내부로 투과하여 internalization이 되는지를 확인하기 위해서 형광 염색한 펩타이드를 종양 세포에 처리 후, 공초점 주사 전자 현미경 (confocal scanning microscopy)으로 관찰하였다. HBD peptide의 종양 세포의 apoptosis에 대한 효과를 측정하기 위해서 펩타이드를 각각 0, 25, 50, 100, 200 μM의 농도로 처리하였다. 펩타이드 처리 48 시간 후, western blot assay를 시행하여 apoptosis 관련 단백질들 (Bcl-xl, PARP, Cas-3)의 발현 여부를 관찰하였다. 마지막으로, Slot blot 분석을 이용하여 HBD peptide가 heparin과의 결합 친화성 및 종양 세포의 증식에 필수적인 VEGF (Vascular endothelial growth factor)와 결합 친화성을 관찰하였다.

3. 결 과

BMP-4에서 도출한 Heparin Binding Domain (HBD) peptide의 농도가 증가함에 따라서 종양 세포 내부로 투과되는 펩타이드의 양이 증가하는 경향을 나타내었다. 즉, HBD peptide의 세포 투과 능력을 확인할 수 있었다. HBD peptide를 처리한 종양 세포에서 Bcl-xl은 감소하는 경향을 보였고, PARP cleaved form 및 Caspase-3의 cleaved form이 증가하는 경향을 보였다. 이것은 HBD peptide가 종양 세포의 apoptosis에 영향을 줄 수 있음을 의미한다. HBD peptide의 농도가 증가할수록 heparin 및 VEGF와의 결합이 증가하는 경향을 관찰하였다. 이러한 결과를 통하여 HBD peptide의 heparin 과의 결합 친화성을 확인하였고, HBD peptide가 VEGF와 결합을 통해 종양 세포 증식 억제에 영향을 줄 수 있음을 확인하였다.