치수세포에 대한 과산화수소 세포독성 및 치과용 레진 단량체의 분화 저해 기전 연구

Abstract

1. 목 적 치과용 미백제의 주요 활성물질인 과산화수소는 구강세포에 산화 스트레스를 유발하여 세포독성을 유발할 수 있으며, 치수세포는 치수강을 통하여 과산화수소에 노출될 위험이 있다. 또한 치수세포는 레진계 상아질 접착제 및 수복 재료에서 유출되는 미중합 레진 단량체에 노출될 위험성이 항상 존재한다. 치수세포는 3차 상아질의 형성에 매우 중요한 역할을 담당하므로, 과산화수소 및 레진 단량체 등의 외부 독성 물질에 의해 치수세포의 기능이 저해될 수 있으며, 최종적으로 치아의 수명이 감소할 수 있다. 본 연구에서는 과산화수소의 농도와 노출시간을 달리하여 치수세포의 생존율을 조사하고, 임상에서 사용되는 치아 미백제의 독성 연구에 기초 자료를 제시하고자 하였다. 또한 레진 단량체 중에서 유출이 가장 많이 되는 것으로 알려져 있는 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA)와 triethylene glycol dimethacrylate (TEGDMA)의 치수세포 분화 저해 정도를 조사하고, 분화 저해 기전을 밝히고자 하였다.

2. 방 법 다양한 농도의 과산화수소로 노출시간을 달리하여 치수세포을 처리하였으며, 세포독성은 WST 법 (modified MTT 법), 치수세포 내 활성산소종은 2`,7`-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA)를 이용하여 측정하였다. 비가역적 세포사멸을 초래하는 과산화수소의 농도 및 노출시간을 결정하였으며, 활성산소 측정을 통하여 세포사멸에 대한 hydroxyl radical의 기여 정도를 조사하였다. 치수세포 분화에 대한 HEMA 및 TEGDMA의 영향은 세포독성을 나타내지 않는 농도에서 조사하였다. 분화에 대한 영향 평가를 위해 alkaline phosphatase (ALP) 활성, dentin sialophosphoprotein (DSPP), osteocalcin (OCN), osteopontin (ONV)의 발현을 관찰하였다. 레진 단량체의 분화 저해 기전을 조사하기 위하여, ERK1/2, JNK, p38 발현 변화를 분석하였다.

3. 결 과 과산화수소가 치수세포의 생존율에 미치는 영향을 평가한 결과 과산화수소의 노출농도와 노출시간이 증가 할수록 세포의 생존율이 저하되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 세포 세척시간이 길수록 세포 생존율이 효과적으로 회복되는 것이 관찰되었다. 과산화수소에 30분 동안 5 mM이하, 60분 동안 2.5 mM이하 노출된 치수세포는 세척시간에 따라 세포 생존율이 회복되는 가역적인 세포독성을 나타내었다. 그러나 보다 높은 농도에서 오랜 시간 과산화수소에 노출될 경우 세포 생존율이 회복되지 않는 비가역적인 독성이 나타났다. 치수세포 내의 hydroxyl radical은 과산화수소의 노출농도와 노출시간에 비례하여 증가하였다. Fenton reaction inhibitor로 알려진 deferoxamine (DFO)과 과산화수소를 함께 처리하였을 때 효과적으로 hydroxyl radical이 제거 되었지만, 세포의 생존율 회복에는 큰 영향을 미치지 않았다. TEGDMA와 HEMA가 치수세포의 생존율과 ALP 활성도에 미치는 영향을 평가한 결과 단량체의 농도가 증가 할수록 생존율과 ALP 활성도가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. TEGDMA는 1 mM, HEMA는 4 mM 이상의 농도에서 세포독성이 나타났다. ALP 활성도는 TEGDMA 0.5 mM, HEMA 2 mM이상에서 저해되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 단량체들이 제거된 후에도 5일 동안 감소된 치수세포의 ALP 활성도가 완전히 회복되지 못하는 것이 관찰되었다. 세포독성은 나타나지 않지만 ALP 활성도가 저해되는 단량체의 농도 (TEGDMA 0.5 mM, HEMA 2 mM)를 설정하여 치수세포의 유전자에 미치는 영향을 조사하였다. 단량체가 처리된 치수세포는 분화능과 관련된 유전자인 DSPP, OCN, OPN의 발현이 모두 저하된 것을 확인할 수 있었다. Western blot을 통해 단량체가 치수세포의 분화 저해 기전을 조사하였다. 단량체가 처리된 치수세포의 ERK1/2, JNK, p38 단백질 발현 변화를 관찰한 결과 p38이 TEGDMA와 과산화수소에 영향을 받는 것이 관찰되었다. 3시간 동안 TEGDMA 0.5 mM, 과산화수소 0.2 mM에 노출된 치수세포의 p38 단백질 발현이 저하되는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 TEGDMA가 p38 신호전달체계에 변화를 유발하여 최종적으로 치수세포의 분화능 저하를 야기한 것으로 판단된다.