Phenotypes and functions of human dendritic cells stimulated with teichoic acid-deficient staphylococcus aureus

Abstract

1. 연구목적 인간 수지상세포는 전문적인 항원제시세포로서 선천성면역계와 적응면역계를 연결한다. 수지상세포의 표면분자발현, 싸이토카인의 분비 및 T 세포 활성화 능력은 박테리아 세포벽에 위치한 펩티도글리칸, 리포테이코익산, 테이코익산을 포함하는 다양한 병독력인자에 의한 수지상세포의 성숙을 통해 조절된다. 그람양성균의 주요 병독력인자중 하나인 테이코익산의 경우, 수지상세포의 성숙 및 활성화에 미치는 영향이 아직 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 테이코익산이 결여된 돌연변이 황색포도상구균을 사용하여 수지상세포의 활성화에서 테이코익산의 역할을 규명하였다.

2. 연구방법 인간 혈액을 ficoll을 이용한 밀도구배원심분리법으로 분리한 혼합백혈구에서 마그네틱 비드를 이용하여 CD14+단핵구만을 분리하였다. 분리한 단핵구를 GM-CSF (50 ng/ml)와 IL-4 (17.7 ng/ml)를 첨가한 RPMI-1640 에서 6일간 배양하여 단핵구 유래 수지상세포로 분화시켰다. 수지상세포의 성숙과정에 있어서 황색포도상구균 테이코익산의 역할을 연구하기 위하여 수지상세포(1 x 105 cells)에 에탄올로 사멸시킨 황색포도상구균(wild-type)과 테이코익산이 결여된 황색포도상구균 (ΔtagO) 그리고 tagO 유전자 보완 황색포도상구균 (pStagO) 30 μg/ml을 24시간 동안 처리한 후, 수지상세포의 성숙마커인 CD83, CD86, MHC class Ι, MHC class ΙΙ, PD-L1, PD-L2의 발현을 유세포 분석기로 분석하였다. 또한, 효소결합면역분석법(ELISA)을 이용하여 황색포도상구균 자극에 따른 싸이토카인 IL-1β, IL-12, TNF-α, IL-6, IL-10의 발현을 측정하였다. 수지상세포를 매개한 T 세포 활성화에서 테이코익산의 역할을 알아보기 위하여, wild-type 또는 ΔtagO로 24시간 동안 자극한 수지상세포(2 x 104 cells)를 자가 유래 혼합백혈구(2 x 105 cells)와 5일간 공동 배양한 후, CD3+ T 세포의 활성화 마커인 CD25와 MHC class ΙΙ의 발현을 유세포 분석기로 분석하였다. 또한 T 세포의 증식양상을 조사하기 위해서 wild-type 또는 ΔtagO로 자극한 수지상세포와 CFSE로 염색된 혼합백혈구를 공동 배양한 후, CD3+ T 세포를 유세포 분석기로 분석하였다. 마지막으로 wild-type 또는 ΔtagO 로 자극한 수지상세포와 공동 배양한 혼합백혈구의 싸이토카인 IFN-γ 와 IL-10의 발현을 ELISA를 이용하여 측정하였다.

3. 연구결과 Wild-type 황색포도상구균은 인간 단핵구 유래 수지상세포 표면에 동시자극분자 CD83, CD86과 주조직적합복합체 분자 MHC class Ι, MHC class ΙΙ 그리고 PD-L1, PD-L2 분자들의 발현을 현저하게 증가시켰다. 하지만 ΔtagO로 자극한 수지상세포의 경우, wild-type으로 자극한 수지상세포 대비 50% 수준 이하의 CD83, CD86, MHC class Ι, PD-L1 발현을 보였다. MHC class ΙΙ와 PD-L2의 경우, wild-type 대비 유의적 차이가 관찰되지 않았다. 또한, wild-type은 수지상세포의 IL-1β, IL-12, TNF-α, IL-6, IL-10의 생성을 모두 증가시켰지만, ΔtagO는 IL-1β, IL-12, TNF-α의 생성을 유도하지 못하였다. 반면, IL-6와 IL-10의 생성은 유의적 차이가 나타나지 않았다. 수지상세포의 표면분자 발현과 싸이토카인의 분비는 pStagO로 자극시, wild-type과 유사한 수준으로 회복되는 것을 확인하였다. Wild-type으로 자극된 수지상세포는 T 세포 활성화 마커인 CD25와 MHC class ΙΙ의 발현 및 T 세포의 증식을 유의적으로 증가시키지만 ΔtagO로 자극된 수지상세포는 T 세포 활성화마커 발현과 증식이 wild-type에 비하여 현저히 낮은 것을 관찰할 수 있었다. pStagO 자극을 받은 수지상세포에서는 T 세포의 활성 마커 발현 및 증식이 wild-type과 유사한 수준으로 회복되는 것을 확인하였다. 마지막으로 wild-type으로 자극된 수지상세포는 혼합백혈구의 IFN-γ 와 IL-10의 발현을 증가시켰지만, ΔtagO로 자극된 수지상세포는 혼합백혈구의 IFN-γ 와 IL-10의 발현을 증가시키지 못하였고 pStagO로 자극된 수지상세포는 혼합백혈구의 IFN-γ 와 IL-10의 발현을 wild-type과 유사한 수준으로 증가시키는 것을 확인하였다.

4. 결 론 황색포도상구균의 테이코익산은 인간 수지상세포의 동시자극분자, 주조직적합복합체 분자의 증가 및 염증성 싸이토카인 IL-1β, IL-12, TNF-α의 생성을 유도하는데 필수적이고, 수지상세포를 매개한 T 세포의 활성화 및 증식 조절에서 중요한 역할을 수행한다는 결론을 얻었다.

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells linking innate and adaptive immunity. The surface molecule expression, production of cytokine, and lymphocyte-stimulating capacity of DCs are dependent on DC maturation triggered by bacterial cell wall components including wall teichoic acid (WTA), lipoteichoic acid (LTA), and peptidoglycan (PGN). Among those cell wall components, role of WTA in the DC maturation has not been fully understood. In the present study, ethanol-killed S. aureus wild-type remarkably induced the expression of co-stimulatory molecules such as CD83, CD86, major histocompatibility complex (MHC) class I, MHC class II, PD-L1 and PD-L2 in human monocyte-derived DCs. In addition, Wild-type S. aureus significantly induced the production of pro-inflammatory cytokines such as tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin (IL)-12, and IL-1β. In contrast, WTA-deficient S. aureus (ΔtagO) failed to induce the expression of such molecules and cytokines under the same condition. Wild-type S. aureus-stimulated DCs significantly increased the expression of T cell activation markers, CD25 and MHC class ΙΙ, and T cell proliferation when DCs were co-cultured with PBMC. However, ΔtagO-stimulated DCs weakly induced the T cell activation and proliferation under the same condition. Wild-type S. aureus-stimulated DCs also increased interferon-γ and IL-10 expression in PBMC but ΔtagO-stimulated DCs could not. Expression of T cell activation markers, T cell proliferation and cytokine-producing ability of PBMC were restored by DCs stimulated with pStagO. Collectively, WTA might be an important cell wall component of S. aureus in the differentiation and activation of DCs.