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Inhibitory effect of Lactobacillus plantarum lipoteichoic acid on Pam2CSK4-induced IL-8 production in Caco-2 cells
Caco-2 세포에서 Pam2CSK4에 의해 유도된 IL-8 발현에 대한 Lactobacillus plantarum lipoteichoic acid의 억제효과

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Authors
노수영
Advisor
한승현
Major
치과대학 치의과학과
Issue Date
2014-08
Publisher
서울대학교 대학원
Keywords
Lactobacillus plantarumLipoteichoic acidPam2CSK4Interleukin-8Intestinal epithelial cells대장상피세포
Description
학위논문 (석사)-- 서울대학교 대학원 : 치의과학과, 2014. 8. 한승현.
Abstract
1. 연구목적
유산균은 인간과 동물의 소화기관에 존재하며 숙주에 유익한 영향을 주는 세균으로 알려져 있다. 유산균에 의해 장내 염증반응이 완화된다고 보고되고 있지만 정확히 유산균의 어떤 물질에 의해 장내 염증반응이 억제되는지에 대해서는 아직 잘 알려져 있지 않다. 따라서 본 연구는Lactobacillus plantarum의 주요 구성물질 중 하나인 lipoteichoic acid (LTA)가 인간 대장 상피세포에서 IL-8과 같은 전염증성 사이토카인의생산을 조절할 수 있는지에 대해 알아보았다.
2. 연구방법
인간의 대장상피세포주인 Caco-2 세포에 S. aureus RN4220과 그 돌연변이체들을 처리하여 IL-8의 발현양상을 역전사효소 중합연쇄반응(RT-PCR)로 알아보았다. 세균의 지질단백질은 염증 유발에 중요하다고알려져 있는데, 이를 모방하여 합성한 Pam2CSK4를 Caco-2 세포에 다양한 농도 및 시간으로 처리하여 IL-8의 발현양상을 RT-PCR과 효소결합면역분석법 (ELISA)을 이용하여 관찰하였다. 유산균 및 그 구성요소가Pam2CSK4에 의해 유도된 IL-8 발현에 어떠한 영향을 주는지 알아보기위해, Caco-2 세포에 열에 의해 불활성화된 L. plantarum을 다양한 농도로 처리하거나, L. plantarum의 펩티도글리칸과 여러 종류의 유산균 LTA를 Pam2CSK4와 동시에 처리하여 IL-8의 발현을 RT-PCR로 확인하였다. Caco-2 세포에 Pam2CSK4와 L. plantarum LTA (Lp.LTA)를 동시에 처리하여 IL-8의 생산을 ELISA를 통해 측정하였다. 또한, Lp.LTA의 구조적 차이에 따른 영향을 알아보기 위해 Caco-2 세포에 D-alanine이 제거된 Lp.LTA와 아실 사슬이 제거된 Lp.LTA를 Pam2CSK4와 동시에 처리하여 IL-8 생산을 ELISA를 통해 측정하였다. 톨유사수용체-2 (TLR2)의활성을 알아보기 위해, CD14와 TLR2를 과발현하며 CD25 리포터 유전자를 가진 CHO/CD14/TLR2 세포에 Pam2CSK4와 Lp.LTA를 동시에 처리한 후 NF-κB 활성을 통한 CD25 발현을 유세포분석기로 측정하였다. 세포내부 신호전달을 알아보기 위해 Caco-2 세포에 Pam2CSK4와 Lp.LTA를 동시에 처리한 후 p38, ERK, JNK 등의 세포 내 신호전달 매개인자와IκBα의 발현양상과 인산화 정도를 웨스턴 블롯법으로 관찰하였다.
3. 연구결과
Caco-2 세포에서 S. aureus RN4220에 의해 IL-8이 생산되었으나 지질단백질을 가지고 있지 않은 S. aureus 돌연변이체에 의해서는 IL-8이 생산되지 않았다. 또한, Pam2CSK4는 IL-8의 발현을 강하게 유도하는 것을관찰하였다. 따라서 S. aureus의 지질단백질이 장에서 염증을 일으키는중요한 인자라는 것을 알 수 있었다. 열에 의해 불활성화된 L. plantarum
은 IL-8의 발현을 유도하지 못했지만 Pam2CSK4 자극에 의한 IL-8의 발현을 조금 억제하였다. 유산균의 세포벽 구성물질 중 Lp.LTA의 농도가증가할수록 Pam2CSK4에 의해 유도된 IL-8의 발현이 현저히 억제되었다.하지만, L. delbruekii, L. rhamnosus GG의 LTA는 IL-8 발현을 조금밖에 억제하지 못했으며 L. sakei LTA는 전혀 억제하지 못했다. Lp.LTA와는 대조적으로 L. plantarum의 펩티도글리칸은 IL-8 발현을 전혀 억제하지 못했다. 또한, 아실 사슬이 결여된 Lp.LTA는 Pam2CSK4에 의해 유도된 IL-8 생산을 억제하지 못했다. 이것은 Lp.LTA에서 지질 성분이Pam2CSK4에 의해 유도된 IL-8 생산을 억제하는데 중요하다는 것을 의미한다. CHO/CD14/TLR2 세포에 Pam2CSK4를 처리했을 때 TLR2의 활성이 매우 강하게 유도된 반면 Pam2CSK4에 의해 유도된 TLR2의 활성은 Lp.LTA에 의해 억제되었다. 또한, Pam2CSK4가 p38 kinase 과 JNK와 같은 마이토젠활성 단백키나아제의 인산화를 증가시켰지만, Lp.LTA가이들의 인산화를 눈에 띄게 감소시켰다. IκBα는 Pam2CSK4에 의해 현저히 분해되었지만 Lp.LTA가 존재할 때는 Pam2CSK4에 의한 IκBα 분해가일어나지 않았다. 결론적으로, Lp.LTA는 Pam2CSK4에 의한 TLR2 활성화를 억제함으로써 p38 kinase 와 JNK와 같은 세포 내 신호전달 매개인자의 인산화를 감소시키고 IκBα의 분해를 방해하여 Caco-2 세포에서Pam2CSK4에 의해 유도되는 IL-8 생산을 억제한다는 것을 알 수 있었다.
The genus Lactobacillus is considered as predominant bacteria in the gastrointestinal tract of humans and animals and has been associated with beneficial effects on the host. Although it has been well known that Lactobacillus alleviates intestinal inflammation, the precise mechanisms by which bacterial components of Lactobacillus attenuate the inflammatory responses in the intestine have not been clearly understood. In this study, we investigated the inhibitory effect of a major bacterial component, lipoteichoic acid of L. plantarum on the production of interleukin (IL)-8 in a human intestinal epithelial cell line, Caco-2 cells. Staphylococcus aureus significantly induced mRNA expression of IL-8, but lipoprotein deficient S. aureus did not induce the expression of IL-8 in Caco-2 cells. Among microbial components tested in this study, Pam2CSK4, which is known to mimic Gram-positive bacterial lipoproteins, significantly induced IL-8 expression in a dose-dependent manner in Caco-2 cells. Although heat-inactivated L. plantarum slightly inhibited Pam2CSK4-induced IL-8 mRNA expression, L. plantarum LTA (Lp.LTA), but not its peptidoglycan, significantly inhibited Pam2CSK4-induced IL-8 expression. De-acylated or de-alanylated Lp.LTA failed to inhibit Pam2CSK4-induced IL-8 production, suggesting that lipid and D-alanine moieties are critical for the inhibitory effect of Lp.LTA on Pam2CSK4-induced IL-8 expression. Pam2CSK4-induced Toll-like receptor 2 (TLR2) activation was significantly reduced by Lp.LTA in CHO/CD14/TLR2 cells. Furthermore, Lp.LTA remarkably diminished Pam2CSK4-induced the phosphorylation of p38 kinase and JNK. In addition, IκBα was degraded in the presence of Pam2CSK4, but the degradation of IκBα was not observed in the presence of Lp.LTA. Collectively, these results suggest that Lp.LTA inhibits Pam2CSK4-induced IL-8 production through the decrease of phosphorylation of MAP kinases such as p38 kinase and JNK and the blocking of IκBα degradation via the decreased TLR2 activation in human intestinal epithelial cells.
Language
English
URI
https://hdl.handle.net/10371/131142
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