The Single Molecule Study of PBCV-1 Topoisomerase II

Abstract

Type II topoisomerase (토포이소머라아제 또는 토포)에 의한 DNA 잘림은 초나선꼬임의 풀림에 있어서 중요한 과정이다. 본 연구실에서는 클로렐라 바이러스의 토포를 실험모델로서 프렛을 이용한 단일분자수준의 연구를 진행하였다. 그 결과 클로렐라 바이러스의 토포가 인간의 토포보다 마그네슘 이온에 의한 DNA 구부림이 훨씬 높게 나타났다. 나아가서 인간의 토포와는 달리 마그네슘 이온농도 증가에 민감하지 않은 또다른 DNA 구부림 상태가 존재한다는 것 역시 발견되었다. 효소의 결합 측정의 척도가 되는 형광신호증가 현상을 관찰한 결과 클로렐라 바이러스 토포가 DNA에 결합하는 시간은 극도로 길었고. 이렇게 긴 결합시간으로 인해 단일 단백질분자의 결합 및 분리속도를 측정할 수 없었으나, 한번 결합했을 경우 분리되지 않고 오랫동안 결합상태를 유지한다는 특성을 확인한 후, 이를 이용해서 DNA 구부림 및 펴짐, 잘림 및 재결찰 속도를 측정할 수 있었다. 관측된 DNA 구부림 속도는 2.5mM 마그네슘 이온 농도에서 1.25mM 마그네슘 조건보다 빨랐으며, 잘림 속도 역시 2.5mM 마그네슘 이온 농도에서 더 높게 나타났다. 이는 높은 마그네슘 농도에서는 더 적은 구부림 빈도에도 DNA 잘림이 잘 일어나는 현상을 보여준다.

Type II topoisomerase-induced DNA cleavage is an important step in supercoiling relaxation. The topoisomerase of Paramecium Bursaria Chlorella Virus-1 (PBCV-1) was investigated and characterized in this study. Single-molecule Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) showed that Mg2+-induced dynamic bending fraction was much higher than that of the human topoisomerase IIα. Moreover, another bending state that was insensitive to the Mg2+ concentration was discovered. This bending state was not observed in human topoisomerase IIα. The total fluorescence intensity enhancement showed that PBCV-1 topoisomerase II had an extremely long binding time. Due to this long binding time, the binding and dissociation rates could not be measured. However, the bending, straightening, cleavage and re-ligation rates were measured since a single enzyme rarely dissociates after its binding. The bending rate and cleavage efficiency of PBCV-1 topoisomerase II in 2.5mM Mg2+ were higher than in 1.25mM Mg2+. This result shows that the bending frequency between cleavages is reduced when more Mg2+ is presented.