The effect of bilirubin on the regulations of triglyceride synthesis in Streptozotocin-induced diabetes mellitus nephropathy

Abstract

개요

도입: 적당한 빌리루빈은 항산화 및 항염증 작용 등을 통해 생리학적으로 중요한 세포보호작용을 한다. 그리고 전에 우리는 DM Rat을 이용한 실험에서 빌리루빈이 신장의 고빌리루빈혈증 예방작용도 한다는 것을 확인하였다. 본 실험에서 우리는 STZ 유도 후에 빌리루빈을 처리한 새로운 모델을 사용하여 당뇨병성 신장증에서 빌리루빈이 신장과 triglyceride의 합성에 어떤 영향을 주는지 확인하려고 시도하였다.

방법: 본 실험에 18마리의 male SD Rats를 사용하였고 그 중에서 13마리는 60mg/kg 용량으로 STZ를 주사하여 DM을 유도하였으며 기타 Rats은 vehicle citrate buffer(PH 4.5)로 처리하였다. 8시간이 지난 후 13마리 DM Rats에서 5마리를 임의로 선택하여 0.3mg/ml bilirubin 처리를 하고 이들을 Bil group이라고 명명하였다. 5주 후 Rats의 몸무게, 물 섭취량, 음식 섭취량 등 기본적인 자료를 수집하였고 간과 신장을 적출하였으며 PAS 염색, TUNEL 염색, ROS 측정 그리고 western blotting을 실시하였다. PMC 모델: 초기혈관사이세포를 준비하고 모두 세 그룹(control, DM, Bil)으로 나누었다. 먼저 모든 그룹은 정상치의 글루코스 환경에서 배양하다가 하루가 지난 후 DM 그룹과 Bil 그룹은 고농도 글루코스 환경으로 바꿔 배양하였으며 또 하루가 지난 뒤 Bil 그룹은 빌리루빈 처리를 하였다. 마지막에 이 세포들을 이용하여 western blotting을 실시하였다. 간암세포모델은 PMC 모델과 동일한 방법으로 만들었다. iRNA transfection model: 빌리루빈이 TG regulating gene에서의 효과를 확인하기 위하여 iRNA transfection 방법을 이용하여 간암세포에서 target gene의 발현을 억제시킨 후 세포를 거둬들여 PCR과 western blotting을 진행하였다.

결과: STZ 유도 실시 5주 후 DM 모델에서 당뇨병증상이 나타났다. 빌리루빈은 이런 증상을 일정한 정도에서 개선하며 Bil 그룹에서 혈중 TG 농도는 DM 그룹보다 낮았다. 그리고 Bil 그룹에서 빌리루빈은 24시간 내의 소변알부민의 배설과 H2O2 생성을 감소시켰다. 신장조직에서 빌리루빈은 NADPH 산화효소에 의존하는 oxidative end 산물을 감소시킨다. Bil 그룹은 DM 그룹보다 사구체의 섬유화와 세포사멸이 훨씬 적게 나타났다. 신장조직에서 빌리루빈은 TGF-beta 합성과 triglyceride 합성에 관련된 일련의 유전자 발현을 감소시킨다. 간 조직에서 TG의 양은 DM 그룹이 Bil 그룹보다 적으며 빌리루빈은 역시 triglyceride 합성에 관련된 유전자의 발현을 억제한다. PMC 모델에서도 간암세포 모델과 동일한 결과를 확인했다. iRNA transfection 모델에서 빌리루빈은 이중 조절인자이며 일정한 낮은 레벨에서 TG 합성에 관련된 유전자의 발현을 유지한다.

결론: 빌리루빈은 사구체의 여과막을 완전하게 유지하는 것을 통해 단백뇨를 완화하고 세포사멸의 개선과 혈관확장작용을 통해 proximal tubules의 생존능력을 제고하며 따라서 당뇨병성 신장증의 진행을 지연시킨다. 빌리루빈은 지질에 의한 TGF-β 생산을 감소시키고 신장 조직의 섬유화 진행을 개선하였다. 빌리루빈은 DM에서 triglyceride의 합성을 감소할 뿐만 아니라 정교한 조절을 통해 Triglyceride의 낮은 수준을 유지해 준다.

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키워드 : , 빌리루빈, 당뇨병신장병, triglyceride의 합성 , antiapoptosis, 항산화, TGF-β

Abstract

Introduction: Modest level of bilirubin is a major physiologic cytoprotectant by antioxidation, anti-inflammation and others. Also our previous experiment confirmed hyperbilirubiemias protective effect of kidney in DM rat. And we tried to go further and reveal the effect of bilirubin on kidney and triglyceride synthesis in DM nephropathy by employing a new model which bilirubin was treated after STZ-induction.

Methods: Eighteen male SD rats were prepared, and 13 (DM group and Bil group) of them were induced DM by single injection of STZ at a dose of 60mg/kg and others were treated with vehicle citrate buffer PH 4.5. After 8 hours, 5 rats which were randomly selected from the 13 DM rates were treated with 0.3mg/ml bilirubin and marked as Bil group. Five weeks later basal data were collected, kidney and liver were harvested. PMC model: Primary mesangial cells were also prepared, and divide into three groups (control, DM, Bil). First all groups were cultured in normal glucose environment, then 1 day later, Bil group and DM group were changed to high glucose culture, and 1 day later, Bil group was treated with Bilirubin , finally the cells were harvested . Hepatoma cells model: Hepatoma cells were treated in the same way as PMC model. iRNA transfection model: Expressions of target gene were silenced in order to determine the effect of bilirubin on TG regulating genes by employing siRNA transfection procedure in hepatoma cells model ,and cells were harvested .

Results: 5 weeks after STZ –induction, diabetic symptoms appeared in the DM model. Bilirubin improved these symptoms to some extent. And blood TG concentration in Bil group was lower than that in DM group. Bilirubin decreased the 24 hour urine albumin excretion and also urine H2O2 production in Bil group. In kidney tissue, bilirubin decreased NADPH oxidase dependent oxidative end products. The fibrosis and apoptosis situation of glomerular in Bil group was much better than that in DM group. Bilirubin decreased TGF-beta synthesis in kidney tissues, and also decreased a series of gene expressions which were involved in triglyceride synthesis. In liver tissue, the amount of TG in DM group was less than that in Bil group, and bilirubin also inhibited the gene expressions which were involved in triglyceride synthesis. PMC model and hepatoma cells model confirmed the same results. In iRNA transfection model, Bilirubin acted as a dual regulator. It maintained the expression of genes which involved in TG synthesis in a certain lower level.

Conclusions: Bilirubin alleviated proteinuria by maintaining the integrality of the glomerular filtration membrane and promoting renal proximal tubules viabilities through apoptosis improvement and might also by its vasodilation effect, then delayed the progression of diabetic nephropathy. Bilirubin also reduced the lipid-induced TGF-beta production and improved the fibrosis situation in kidney tissue. Bilirubin didnt only decrease triglyceride synthesis in DM, but also maintain the triglyceride in a lower level through elaborate regulations. ------------------------------------------------------------------------------------------------------- Keywords: Bilirubin, DM nephropathy, Triglyceride synthesis, antiapoptosis, antioxidants, TGF-beta