Monitoring of Porcine Endogenous Retrovirus (PERV) in the Xenotransplanted Primates

Abstract

돼지 내인성 레트로바이러스 (Porcine Endogenous Retrovirus

PERV) 는 이종장기이식에 있어서 극복해야 할 과제이다. 그러므로 이식 전 검사로 적절한 공여 동물을 선택하는 것과 이식 후 수여자에서 바 이러스의 레벨을 확인하는 것은 안전성 측면에서 중요하다. 이러한 확인 방법으로 바이러스의 감염 확인을 위한 pol 유전자, 돼지세포 오염 구별을 위한 돼지 사립체 사이토크롬 산화효소 (mitochondrial cytochrome oxidase Ⅱ

COⅡ) 유전자 그리고 내부대조로써 원숭이 의 글리세르알데히드-3-인산 디히드로게나아제 (gyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase

GAPDH) 유전자를 표적으로 하는 다중 실시간 중합효소 연쇄반응 (multiplex real-time PCR)을 개발하였다. PERV에 사용되는 프라이머와 프로브는 기존 연구에서 밝혀진 SNU 미니돼지의 유전자 내 공통으로 보존된 부위를 선택하였을지라도, 다른 돼지 종과 여러 암 세포 주에서도 검출할 수 있는 것을 확인 하였다. 게다가, 검출한계는 20μl의 반응 당 유전자 5-10개 이었고, 기존에 사용되고 있던 방법인 네스티드 중합효소 연쇄반응 (nested PCR)과 비교하여 비슷한 정도인 것을 확인하였다. 다중검출이 단일 검출보다 민감성이 다소 떨어지더라도 한 번에 반응을 확인하여 오류를 낮출 수 있는 장점이 있다. 다중 실시간 중합효소 연쇄반응을 여러 돼지 종에서 적용하여 COⅡ와 비교해 돼지 PERV pol의 비율을 구한 결과, PK15 암 세포주와 비교하여 SNU 미니돼지에서 평균 5.8배 높은 것을 확인하였다. 또한, PERV의 감염여부를 이종 이식된 원숭이 혈액과 조직에서 검사한 결과, 모든 샘플에서 검출되지 않았 음을 확인하였다. 이러한 결과들은 세 가지 형광의 표지 된 실시간 중합효소 연쇄반응이 공여 돼지 내에서 PERV의 레벨을 확인하여 적절한 공여개체를 선택하게 할 수 있을 뿐만 아니라, 이종이식 후, 영장류 전임상 실험과 사람 환자에게 적용하여 바이러스가 수여자 에게 전이될 수 있는지 확인할 수 있는 두 가지의 역할을 할 수 있 음을 보여준다.

The infection risk of porcine endogenous retrovirus (PERV) to human is considered an obstacle in the field of pig-to-human xenotransplantation. Therefore, pre-screening and post-monitoring of PERV in donor pigs and transplanted recipients respectively are critical in the aspect of biosafety. The development of multiplex real-time PCR technology was applied for the detection of PERV pol to determine the PERV infectivity, pig mitochondrial cytochrome oxidase Ⅱ (COⅡ) to distinguish the contamination of pig cells, and monkey glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) to use as an internal control. Although the primers and probes were chosen based on the consensus sequences from SNU miniature pigs, the performances of quantitative multiplex PCR assays were effective in the cells from other pig strains. In addition, the detection limits of the singleplex and multiplex methods were 5-10 copies per 20μl reaction which was similar to the detection limits of nested PCR. Even though the sensitivity was slightly lower in multiplex real-time PCR, it had the advantage of reactions in one tube to reduce error rate in case of the usage in different tubes. Multiplex real-time PCR assays performed on various pig breeds determine the ratio of PERV pol to pig COⅡ. The average of pol ratio in three SNU miniature pigs was 5.8-fold higher than the ratio in PK15 cell line. Also, the amplification on xenotransplanted samples showed that PERV did not transmit to Rhesus macaque recipients. These results demonstrate that the triple labeled real-time PCR assay developed in this study can use as both a screening tool to examine PERV proviral load in donor pigs and a monitoring tool to examine PERV transmission in non-human primates (NHP) and human recipients after xenotransplantation.