Characterization of the CDC6 as a Substrate of N-terminal Arginylation in the N-end Rule Pathway

Abstract

진핵생물에서 단백질 분해 기작은 크게 유비퀴틴-프로테아좀 시스템과 오토파지-라이소좀 시스템 두 가지로 구성된다. N-end rule pathway는 단백질의 N-말단에 존재하는 아미노산 종류에 따른 단백질의 안정성 조절과 관련된다. 포유류의 N-end rule pathway에서 단백질의 불안정 N-말단 잔기는 그 단백질의 유비퀴틴화와 26S 프로테아좀에 의한 분해를 매개하는 N-recognins에 의해 인식된다. 포유류 N-recognins은 UBR box 단백질이라고 불리는 E3 ligases이며 이것은 UBR1, UBR2, UBR4, UBR5로 구성된다. 최근 본 그룹에서 처음으로 N-말단 아르기닌이 오토파지 분해신호(autophagic degron)라는 것을 소포체 샤페론인 BiP을 이용해서 증명하였다. 본 연구실에서는 genome-wide functional proteomic screening을 통해서 CDC6가 N-end rule 기질로 추정되는 단백질이라는 것을 발견하였으며 이 단백질을 우리의 연구를 일반화하기 위한 세포질 단백질의 모델 기질로서 사용하였다. 먼저 N-말단 아르기닌화 CDC6 펩타이드 (R-CDC6 펩타이드)를 이용해 토끼에서 다클론 R-CDC6 항체를 제작하였다. 이 특이적 항체를 이용한 웨스턴 블롯과 면역염색 방법을 통해 in vivo에서 N-말단 아스파르트산을 가지는 caspase-3에 의해 생성되는 C-말단 단백질 조각이 ATE1에 의해 N-말단 아르기닌화 되는 것을 규명하였다. 본 연구는 CDC6 조각이 프로테아좀에 의해 분해되는 새로운 N-end rule 기질이라는 것을 증명하였고, BRCA1의 C-말단 조각 또한 N-말단 아르기닌화 되고 N-end rule pathway에 의해 분해되는 것을 관찰하였다. X-peptide pull-down assays는 이 두 가지 아르기닌화 된 단백질들이 그들의 N-말단 아르기닌을 통해 오토파지 어댑터인 p62/SQSTM1과 물리적으로 결합하는 것을 보여준다. 또한 p62의 ZZ 도메인이 N-말단 아르기닌의 결합위치라는 것을 p62 점돌연변이와 결실 돌연변이를 이용하여 규명하였다. 아르기닌화 허용 N-말단 잔기들인 아스파르트산과 글루탐산을 가지는 다른 많은 종류의 단백질들도 N-말단 아르기닌화-의존적 방식으로 p62와 상호작용하는 것을 관찰하였다. 본 연구에서는 단백질 조각의 N-말단 아르기닌의 N-degron으로서의 두 가지 기능을 제시한다. 이미 잘 정립되어있는 첫 번째 기능은 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에서 분해신호로 작용하는 것이다. 두 번째는 오토파지에서 오토파지 분해신호로 기능할 수 있는 새로운 역할이다. 이를 통해 본 연구는 N-말단 아르기닌화와 오토파지 사이의 관계에 대한 새로운 이해를 제공한다.

In eukaryotes, there are two machineries of protein degradation system composed of ubiquitin-proteasome system (UPS) and autophagy-lysosome system. The N-end rule pathway relates the regulation of the stability of a protein to the nature of its N-terminal amino acid. In mammalian N-end rule pathway, destabilizing N-terminal residues of proteins are recognized by N-recognins that mediate protein ubiquitination and degradation through 26S proteasome. Mammalian N-recognins are E3 ligases called UBR box proteins composed of UBR1, UBR2, UBR4 and UBR5. Recently, our group was the first to validate that N-terminal Arg is an autophagic degron using endoplasmic reticulum (ER)-residing chaperone BiP. Through a genome-wide functional proteomic screening, CDC6 (cell division cycle 6) was found as a putative N-end rule substrate in our lab and used as a model substrate of cytosolic protein to generalize our study in this report. First, we raised a rabbit polyclonal anti-R-CDC6 antibody using N-terminally arginylated form of CDC6 peptide (R-CDC6 peptide). Immunoblotting and immunostaining analyses with this specific antibody show that caspase3-generated C-terminal fragment of CDC6 bearing N-terminal Asp is N-terminally arginylated by Arginyl-tRNA-protein transferase 1 (ATE1) in vivo. My results show that the CDC6 fragment is a new N-end rule substrate degraded by proteasome, and other C-terminal fragment of BRCA1 (breast cancer susceptibility type 1 gene product) is N-terminally arginylated and degraded by N-end rule pathway. X-peptide pull-down assays demonstrate that these two arginylated proteins physically bind to autophagic adaptor p62/SQSTM1 through their N-terminal Arg. I also identify that a ZZ-type zinc finger domain (ZZ domain) of p62 is a binding site for N-terminal Arg using p62 point and deletion mutants. Moreover, I show that many kinds of protein fragments bearing arginylation-permissive N-terminal residues such as Asp and Glu also interact with p62 in an N-terminal arginylation-dependent manner. In this study, my results propose that N-terminal Arg of the protein fragment has a dual function as an N-degron. First one is a degradation signal for UPS, which is well established already. The other is a new role that can act as an autophagic N-degron in autophagy. This report provides new insights into the connection between N-terminal arginylation and autophagy.