간 쿠퍼세포의 양전자단층촬영을 위한 나노 마이셀의 개발

Abstract

서론: 마이셀은 크기가 알부민과 비슷하거나 조금 크고, 표면이 PEGylation 되어있어 면역체계에 대한 masking 기능을 하여 Blood circulation을 길게 할 수 있다. 이를 양전자 방출핵종을 표지하여 PET 영상을 얻고 간 섭취를 확인하여 보았다. 방법: 특이적 엠피파일 (Amphiphile)을 이용한 마이셀 (Micelle)을 제조하기 위해서 SCN-Bn-NOTA 와SCN-Bn-Mannose 를 stearylamine 과 결합시킨 NOTA-SA과 Mannose-SA 을 준비하였다. 이때 Mannose 는 간의 망상세포계 (reticuloendothelial system) 에 존재하는 쿠퍼세포 (Kupffer cell) 를 통한 마이셀의 간 섭취를 확인하기 위한 표적용 물질로 사용하였다. NOTA 는 68Ga, 64Cu를 표지하기 위한 킬레이트제로 사용하였다. 마이셀은 특이적 엠피파일을 계면활성제의 일종인 Tween 60 이 녹아있는 수용액과 혼합하여 초음파 분산기를 이용하여 형성하였다. 형성된 마이셀의 크기분포는 DLS 기기를 통해 분석하였다. 마이셀의 보관조건에 따른 안정성을 확인하기 위해 0.9, 1.8, 3.6 % NaCl 용액과 3차 증류수에서 1,5,10 일에 DLS 를 통해 확인하였다. 동물 실험에 이용한 마이셀의 농도를 알아보기 위해 실험에 사용 된 마이셀을 NANOSIGHT 장비를 이용하여 농도를 확인하여 보았다. 또한 최종적으로 전계방출주사전자현미경 (FE-SEM) 을 이용하여 마이셀의 형성을 확인하였다. PET 영상 및 생체 내 분포 (Biodistribution study) 실험을 위해서 동위원소 표지분자체 크로마토그래피 의 일종인 PD-10 desalting column 을 이용하여 분산용매를 생리식염수 (Normal saline)로 교체하였다. 최종적으로 원심필터 (Centrifugal filter, 100K) 를 이용하여 동물실험을 위한 부피를 맞추어 주었다. 이때 표지 된 마이셀의 혈액 내 안정성을 확인하기 위해 사람혈청알부민 (Human serum albumin) 을 이용하여 37 ºC 에서 2시간까지 확인하였다. 또한 마이셀이 표지 후에도 원래의 크기를 유지하고 있음을 확인하기 위해 분자체 크로마토그래피 의 일종인 sephacryl S300 분자체를 이용하여 0 시간, 1 시간, 2 시간 에서의 elution profile 을 보관 후 1일과 10 일째에 각각 확인하여 보았다. PET 영상의 경우 두가지 종류의 마이셀을 이용하여 비교하였다. NOTA 를 포함한 마이셀과 NOTA 와 Mannose 를 모두 포함한 마이셀 을 준비하였다. 이때 Dynamic list mode 를 이용한 1시간 동안의 영상과 2시간째 static 영상을 얻었다. 또한 64Cu 를 이용하여 8시간까지의 영상을 얻었다. 두 가지 동위원소를 이용한 영상은 심장과 간 의 SUV 를 구하여 비교하여 보았다. 결과: 초음파 분산기를 통해 형성된 마이셀의 DLS 를 이용한 크기는 Tween 60 만을 사용한 경우 (MIC) 와 NOTA-SA 을 같이 사용한 경우 (NOTA-MIC), 마지막으로 NOTA-SA 과 Mannose-SA 을 같이 사용한 경우 (NOTA-MIC-Man) 가 각각 7.88 ±1.39 nm, 8.19 ±1.12 nm, 8.04 ±1.02 nm 였다. 마이셀의 보관조건에 따른 안정성을 확인하기 위한 다양한 NaCl 조건에서의 시험결과는 DLS 결과 분해되거나 뭉치는 현상은 관찰되지 않았다. 68Ga-NOTA-MIC 과 68Ga-NOTA-MIC-Man 의 적정 표지농도를 위한 pH 에 따른 표지실험 결과, pH=5 에서 20 μL 의 마이셀 당 750 μCi 의 표지가 제일 적합함을 찾을 수 있었다. 이때 PD-10 desalting column 을 이용한 elution profile을 통해 가장 높은 radioactivity 를 보이는 fraction 을 확인하고 방사화학적 순도는 99 % 이상임을 확인하였다. 또한 표지 후의 DLS 결과 크기가 거의 변화하지 않음을 확인하였다. 이때 0 시간, 1 시간, 2 시간 에서의 elution profile 을 보관 후 1일과 10 일째에 각각 확인한 결과와, 사람 혈청 알부민을 이용한 표지 안정성 실험 결과 마이셀이 뭉치거나 분해되지 않음을 확인 할 수 있었다. PET 영상은 68Ga-NOTA-MIC 과 68Ga-NOTA-MIC-Man 를 이용하여 마우스의 꼬리정맥을 통해 주사하고 (9.99-13.4 MBq /150 μL) 60 분간 dynamic PET 영상을 촬영하고 2시간에 10분간 static 영상을 얻었다. 또한 주사 후 10분이 지난 뒤에 static 으로 5분, 1시간이 경과한 후 static 으로 5분씩 데이터를 얻어서 비교하였다. Dynamic 영상에서는 심장과 간에 각각 동일한 면적의 SUV 를 잡아 비교하였다. 심장의 SUV 는 감소하는 경향을 보였고 간의 SUV 는 별다른 차이를 보이지 않았다. 하지만 간의 SUV 의 경우 초반에 증가하는 양상과 1시간 근처에서 다시 증가하는 양상을 보이는 것처럼 보였고 두 시간째 얻은 static 에서는 68Ga-NOTA-MIC-Man 의 경우가 간에 좀 더 섭취 된 것으로 확인되었다. 또한 static 으로 얻은 주사 후 10분과 한 시간 후 영상에서는 간에서의 섭취의 차이를 볼 수 있었다. 주사 후에 더 오랜 시간 후 의 분포를 확인하기 위해 64Cu 를 동일한 방법으로 표지 하여 0,1,2,4,8 시간 데이터를 static 으로 얻었다. NOTA-MIC-Man 경우가 NOTA-MIC 에 비해 간 섭취가 많은 것을 SUV 를 구하여 알 수 있었다. 결론: 본 논문에서는 마이셀을 이용한 간의 영상을 확인할 수 있는 양전자 방출 촬영용 나노입자를 개발하였다. 특히 표면에 Mannose를 도입할 경우, Mannose 가 도입되지 않은 대조군에 비해 간에 빠르게 흡수되고 오랫동안 머무는 것을 PET 영상을 통해 확인할 수 있었다.