고속 액체 크로마토그래피 질량분석기를 이용한 macrolide계열 항생제의 동시분석법 개발

Abstract

Macrolide계열 항생제는 하나 이상의 디옥시당이 큰 락톤 고리에 결합한 항생물질로 주로 그람 양성균에 효과적이다. penicillin보다 넓은 범위의 미생물에 효과적이라 penicillin 알러지가 있는 환자에 대체용으로 사용된다. Macrolide계열 항생제는 국내에서 세 번째로 많이 사용되는 항생제이며 사용량이 매년 증가하고 있지만 분석법은 표준화가 완료되지 않은 상황인데 특히 몇몇 종은 낮은 자외선 흡광도를 보여주기 때문에 액체크로마토그래프(LC)법에 이용되는 자외선 검출기(UV detector)는 분석에 적합하지 않다. 이에 높은 감도와 정량성을 보여주는 고속 액체 크로마토그래피 삼중 사중극자 질량분석기(HPLC/triple-Q MS)를 이용한 분석법을 개발하였다. 실험에는 10종의 macrolide계열 항생제(내부 표준물질 포함)를 사용하였으며 분석조건 최적화를 위해 이동상의 pH, 조성, 컬럼의 온도 등을 시험하여 각각 0.2%, acetonitrile과 methanol 비율 9 : 1, 45 ℃로 분석조건을 설정하였다. 컬럼은 작은 입자크기임에도 상대적으로 낮은 압력을 보여주는 superficially porous particle octadecylsilica (SPP C18) 컬럼을 사용하였다. 질량분석기를 이용한 분석법 최적화를 위한 분리조건 확인은 scan mode, 정성 및 정량은 multiple reaction monitoring(MRM) mode에서 진행하였으며 각 화합물에 맞게 조건을 설정하였다. 최적화된 분석조건으로 밸리데이션을 수행하였다. 질량분석기 유량한계에 맞추기 위해 분류를 통해 도입유량을 반으로 줄였음에도 검출한계 0.5∼50 ng/mL, 정량한계 1∼500 ng/mL를 나타내었다. 직선성은 0.9974 이상의 r2값을 기록했고 recovery는 77.01∼110.69%, intra-day precision과 inter-day precision은 각각 0.26∼6.21%, 0.71∼25.29%를 나타내었다. 개발된 분석조건의 시험을 위해 시판되는 macrolide계열 항생제에 대한 recovery를 측정하였다. 시험결과 azithromycin은 77.53∼119.88%, clarithromycin은 84.64∼106.79%, roxithromycin은 83.32∼109.22%의 recovery를 나타내었다. 본 연구의 결과 macrolide계열 항생제의 동시분석을 위한 정량법 표준화를 통해 효율성 향상을 기대할 수 있게 되었으며 다른 화합물, 혹은 다른 분석기기를 통한 분석법 개발을 기대할 수 있게 되었다.

Macrolide antibiotics are group of drugs that one or more deoxy sugars attached to the large lactone ring. Macrolides are effective in infections caused by Gram-positive bacteria. Macrolides are a common substitute for the patients who have penicillin allergy due to their wide antimicrobial spectrum. Macrolides are the third most used antibiotics in Korea and consumption is increasing year by year. However, standardization of analytical methods is not completely set. LC/UV, a common instrument for drug analysis, is not suitable for analysis because some macrolide species only have low UV absorbance in low wavelength. For this reason, analytical method by using high-performance liquid chromatography triple quadrupole mass spectrometer(HPLC/triple-Q MS) which shows better sensitivity is developed. 10 macrolides including internal standard were tested for the optimization of analytical conditions-pH of mobile phase, organic solvent composition, and column temperature. After optimization, 0.2% formic acid in mobile phase, 9 : 1 mixture of acetonitrile and methanol, and 45 ℃ of column temperature were selected. Superficially porous particle octadecylsilica(SPP C18) column which shows low pressure with small particle size was used. Scan mode was used to check the separation conditions for the optimization of analytical method and multiple reaction monitoring(MRM) mode was used for qualitative and quantitative analysis using a mass spectrometer. After the analytical conditions were optimized, method validation was performed. Limit of detection(LOD) and limit of quantification(LOQ) show 0.5∼50 ng/mL and 1∼500 ng/mL respectively in spite of the inlet flow reduced to half to match the mass spectrometer flow restriction. Linearity showed more than 0.9974 of r2, recovery records a value of 77.01∼110.69%, intra-day and inter-day precision showed 0.26∼6.21% and 0.71∼25.29% respectively. Developed analytical method was tested with macrolides that are commercially available. Recovery of azithromycin, clarithromycin, and roxithromycin showed 77.53∼119.88%, 84.64∼106.79%, and 83.32∼109.22% respectively. Improvement of efficiency is to be expected for the entire standardization of the assay for the simultaneous analysis of the macrolide antibiotics from this study.