천연물 유래 Alkaloid계 Coptisine의 Epithelial-to-Mesenchymal Transition 억제 연구

Abstract

Epithelial-to-mesenchymal transition (EMT)은 상피세포 (epithelial cell)가 고유의 특성과 cell-cell junction을 잃고 간엽세포 (mesenchymal cell)의 형태와 성질을 획득하는 과정으로 암의 침윤, 전이의 중요한 특징이다. 본 연구에서는 사람 폐암 세포주인 A549를 이용하여 황련 (Coptis japonica)에서 분리된 isoquinoline alkaloid계 물질인 coptisine의 EMT 억제 효능을 확인하고 그 작용기전을 연구하였다. A549세포에 대한 세포 증식 억제 효능을 평가한 결과, coptisine에 의해 세포의 증식이 시간 및 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다 (IC50

42.7 μM (24h), 15.9 μM (48h), 8.4 μM (72h)). EMT와 관련한 작용기전을 알아본 결과, coptisine은 암의 진행을 억제하고 세포간 연결을 유지하여 이동성을 감소시키는 E-cadherin의 유전자와 단백질의 발현을 모두 증가시켰다. 또한 E-cadherin의 내인성 억제제로 작용하는 Snail에도 영향을 미쳐 유전자와 단백질의 발현을 억제하였다. 그 외에 EMT에서 특이적으로 변화하는 matrix metalloproteinase-2 (MMP-2), vimentin, N-cadherin 등에 영향을 미치는 것을 확인하였다. 또한 wound healing assay, colony dispersion assay, invasion assay 등을 통해 coptisine이 A549 세포의 이동성, 침윤성을 저해함을 밝혔다. 더욱 구체적인 EMT 저해 기전을 알아보기 위해 transforming growth factorβ1 (TGFβ1)를 처리한 A549 세포에서 coptisine의 효과를 살펴본 결과 Extracellular signal-regulated kinases (ERK)1/2, Akt, glycogen synthase kinase3β (GSK3β) 의 인산화를 억제하였으며 Smad 신호전달체계도 억제하였다. 이로인해 coptisine이 Snail의 상위 신호전달체계에 영향을 미쳐 Snail의 발현을 저해하는 것을 알 수 있으며, 이러한 coptisine의 Snail 억제와 E-cadherin 증가 작용을 통해 EMT가 효과적으로 저해되는 것으로 여겨진다. 따라서 coptisine은 암 전이 치료의 천연 후보 물질이 될 수 있을 것으로 사료된다. 골 항상성 (bone homeostasis)은 파골세포 (osteoblast)의 골 흡수 (bone resorption)와 조골세포 (osteoblast)의 골 형성 (bone formation)에 의해 유지되며 항상성이 파괴될 경우 골다공증과 같은 골 관련 질환이 발생한다. 조골세포는 Wnt 신호전달체계에 의해 분화가 촉진되어 extracellular matrix (ECM) 단백질의 발현과 무기질화 (mineralization)가 일어나며 이러한 이유로 Wnt 신호전달체계의 활성화는 골다공증 치료제의 새로운 표적으로 여겨지고 있다. 본 연구에서는 천연물 중 바디나물 (Angelica decursiva)에서 분리한 furano-coumarin계열의 nodakenetin이 Wnt 신호전달체계를 활성화시켜 조골세포의 분화에 영향을 미치는지 살펴보았다. Nodakenetin은 인간 신장 배아 세포주인 HEK293 세포와 쥐 전조골세포주인 CM3T3-E1 세포에서 T-cell factor/Lymphoid-enhancing factor (TCF/Lef)의 전사활성을 크게 증가시켰다. Wnt 신호전달체계의 저해자인 Dickkopf1 (DKK1)을 감소시키고 반대로 β-catenin은 크게 증가시켰다. Wnt 신호전달체계의 표적 유전자의 발현을 증가 시켰으며 그 중 조골세포 분화와 관련된 runt-related transcription factor2 (Runx2)의 유전자와 bone morphogenetic protein (BMP)의 발현을 증가시켰다. MC3T3-E1 세포에서 Alizarin red S staining과 alkaline phosphatase (ALP) activity를 수행한바, 무기질화가 증가하고, ALP가 활성화되어 조골세포의 분화를 촉진하는 것을 확인하였다. 결과적으로 nodakenetin은 조골세포의 분화를 촉진하는 골다공증의 치료에 유효한 선도물질로 사료된다.

Coptisine, an isoquinoline alkaloid, is a component of Coptis japonica Makino (Ranunculaceae). C. japonica has been used as a traditional medicine for the treatment of fungal infection and inflammation. The present study was designed to investigate the inhibitory effect of coptisne on epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) in cancer cells. EMT is a differentiation switch in which polarized epithelial cells differentiate into contractile and motile mesenchymal cells. Coptisine showed a potential growth inhibitory activity in human lung cancer A549 cells (IC50= 8.4 μM for 72 h). Coptisine increased E-cadherin promoter activity and the expressions of E-cadherin protein and mRNA level. In addition, coptisine down regulated the EMT-related protein expressions including Snail, MMP-2, vimentin, and N-cadherin. Coptisine also suppressed the expressions of phosphorylated ERK1, Akt and GSK3β in TGFβ-treated or untreated A549 cells. These results indicated that coptisine inhibited upstream signaling of Snail. Further study revealed that coptisine inhibited cell migration in the wound healing and colony dispersion assays. Cell invasion was also mediated by coptisine in the matrigel invasion assay. Coptisine might have a potential anti-metastatic activity, and thus will be a lead candidate as an anti-cancer agent. Nodakenetin, a furanocoumarin compound, is a component of Angelica decursiva (Umbelliferae). A. decursiva is used as a traditional medicine to relive the symptoms associated with allergy and skin whitening. In the present study, the effect of nodakenetin anti-osteoporosis activity was evaluated. The Wnt signaling pathway is an evolutionarily conserved pathway involved in various biological events, including stem cell differentiation, cell motility, and cell proliferation. Activation of the Wnt signaling is known to contribute to differentiation in osteoblast. Nodakenetin was found to have an activation effect β-catenin/T-cell factor (TCF) transcriptional activity in HEK293 cells. The activation sequentially stimulated of Wnt signaling target genes and β-catenin in both HEK293 cells and MC3T3-E1 cells. In addition, nodakenetin surppressed the expression of DKK1, a Wnt inhibitor. Nodakenetin is considered a potent Wnt activator. Nodakenetin markedly increased alkaline phosphatase (ALP) activity and extracellular matrix (ECM) calcium deposits in osteoblast cells. These data demonstrated that nodakenetin activated the Wnt signaling, which increased BMPs and Runx2 expressions, and stimulated osteoblast differentiation. Therefore, the activation of Wnt signaling by nodakenetin is considered to be associated with the anti-osteoporotic activity.