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HPLC-FLD, Q-TOF-MS, exoglycosidase array digestion을 이용한 에타너셉트 N-당사슬 분석법 연구 : Etanercept N-glycosylation Analysis using HPLC-FLD, Q-TOF-MS and exoglycosidase array digestion
DC Field | Value | Language |
---|---|---|
dc.contributor.advisor | 박정일 | - |
dc.contributor.author | 이새봄 | - |
dc.date.accessioned | 2017-07-19T11:21:17Z | - |
dc.date.available | 2017-07-19T11:21:17Z | - |
dc.date.issued | 2015-08 | - |
dc.identifier.other | 000000066596 | - |
dc.identifier.uri | https://hdl.handle.net/10371/133593 | - |
dc.description | 학위논문 (석사)-- 서울대학교 대학원 : 약학과(약품분석학전공), 2015. 8. 박정일. | - |
dc.description.abstract | 에타너셉트 (Etanercept, Enbrel®)는 폴리펩티드 (polypeptide)의 특정 아스파라긴 (Asn, asparagine) 잔기에 N-당사슬 (N-glycan)이 결합되어 있는 당단백질의약품 (therapeutic glycoprotein)이다. 당단백질의약품에 존재하는 N-glycan은 구조적 다양성을 지니며, 의약품의 안정성 (stability), 효능 (efficacy), 항원성 (immunogenecity)과 같은 약리학적 중요 요소에 큰 영향을 미치기 때문에 N-glycan의 불균일성 (heterogeneity)을 입증하기 위한 정성 및 정량적 분석법은 당단백질의약품의 효과적인 품질관리 (QC, quality control) 에 있어 매우 중요하다.
본 연구에서는 당단백질의약품 중 Etanercept에 존재하는 N-glycan의 구조 및 상대정량 분석을 수행하였다. 대상 의약품에 펩티드 N-탈당쇄효소 F (PNGase F)를 처리하여 N-glycan을 유리시킨 후, 유리된 N-glycan에 2-아미노벤즈아미드 (2-AB, 2-aminobenzamide) 형광 표지 (fluorescence labeling)를 한 다음, 고체상 추출 (SPE, solid phase extraction)을 이용하여 2-AB 표지된 N-glycan 혼합물 (mixture)을 분리 정제 하였다. 분리 정제된2-AB 표지된N-glycan mixture를 고성능액체크로마토그래피-친수성 상호작용 액체크로마토그래피법 (HPLC-HILIC, high performance liquid chromatography-hydrophilic interaction liquid chromatography)을 이용하여 분리하고, 연결된 형광검출기 (FLD, fluorescence detector)와 질량분석기 (MS, mass spectrometry)로 분석하였다. 분석 과정 시 각 피크의 머무름 시간 (retention time, RT, min)에 해당하는 당 단위 값 (glucose unit)을 구하기 위하여 2-AB 표지된 당 사다리 (2-AB labeled dextran ladder)를 분석하였다. 2-AB 표지된N-glycan의 구조 분석을 위하여 glucose unit과 online database와 비교하여 얻은 구조와, Q-TOF-MS를 통해 얻은 각 피크의 정확한 분자량 (이론값 대비 오차범위0.01 Da 미만)에 대한 정보, 그리고 하나 이상의 엑소글라이코시다아제 (exoglycosidase)를 동시에 처리했을 때 나타난 피크 면적 변화에 대한 정보들을 모두 조합하여 N-glycan의 구조분석을 수행하였다. 3회 반복실험을 하여 구조가 규명된 각 피크 면적에 대한 상대정량값 (relative peak intensity, %)의 평균표준편차 (relative intensity, RSD, %)값을 구하여 본 분석법의 재현성을 검증하였다 (RSD < 10%). | - |
dc.description.tableofcontents | 국문초록……………………………………………………………………………i
목차……………………………………………………………………………iii List of Figures…………………………………………………………………v List of Tables…………………………………………………………………vi I. 서론……………………………………………………………………………1 II. 실험……………………………………………………………………………3 1. 시료………………………………………………………………………3 2. 시약 및 기기…………………………………………………………………3 2-1. 시약……………………………………………………………………3 2-2. 장비 및 도구…………………………………………………………4 3. 실험 방법………………………………………………………………6 3-1. Enbrel에서 Etanercept의 선택적 분리…………………………6 3-2. 단백질 변성 (protein denaturation)…………………………7 3-3. Etanercept으로부터 N-glycan 유리 (Enzymatic deglycosylation)………………………………………………………………8 3-4. 에탄올 침전법을 이용한 N-glycan 정제 (Ethanol precipitation) …………………………………………………………………9 3-5. 2-AB labeling………………………………………………………10 3-6. Solid phase extraction를 이용한 2-AB 표지된 N-glycan 정제………………………………………………………………………………11 3-7. Exoglycosidase array digestion………………………………13 3-8. Instrumental Analysis………………………………………………15 III. 결과…………………………………………………………………………17 1. 고정상 선정…………………………………………………………………17 2. 2-AB 표지 N-glycan 구조 동정………………………………………19 2-1. Overview……………………………………………………………19 2-2. HPLC-FLD과 GlycoBase를 이용한 2-AB 표지된 N-glycan 구조 예측………………………………………………………………………21 2-3. Q-TOFMS를 이용한 2-AB 표지된 N-glycan 구조 동정…………………………………………………………………………23 2-4. Exoglycosidase를 이용한 2-AB 표지된 glycan 결합 종류 규명………………………………………………………………………….24 3. N-glycan분석법 재현성 검증…………………………………………27 IV. 결론……………………………………………………………………29 V. 참고문헌……………………………………………………………………30 Abstract…………………………………………………………………………33 | - |
dc.format | application/pdf | - |
dc.format.extent | 1322469 bytes | - |
dc.format.medium | application/pdf | - |
dc.language.iso | ko | - |
dc.publisher | 서울대학교 대학원 | - |
dc.subject | 당단백질의약품 | - |
dc.subject | N-glycan | - |
dc.subject | exoglycosidase | - |
dc.subject | fluorescence | - |
dc.subject | mass spectrometry | - |
dc.subject.ddc | 615 | - |
dc.title | HPLC-FLD, Q-TOF-MS, exoglycosidase array digestion을 이용한 에타너셉트 N-당사슬 분석법 연구 | - |
dc.title.alternative | Etanercept N-glycosylation Analysis using HPLC-FLD, Q-TOF-MS and exoglycosidase array digestion | - |
dc.type | Thesis | - |
dc.contributor.AlternativeAuthor | Sae Bom Lee | - |
dc.description.degree | Master | - |
dc.citation.pages | 43 | - |
dc.contributor.affiliation | 약학대학 약학과 | - |
dc.date.awarded | 2015-08 | - |
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