Elastic Body Model for Understanding of Enzyme Mechanical Forces and Its Applications to Enhance Enzyme Activity

Abstract

효소는 유용한 생체 물질임과 동시에 산업적으로 널리 쓰일 수 있다. 그러므로 돌연변이에 의한 효소의 활성 변화 원리를 이해하는 것은 의학 및 산업에서 광범위한 응용으로 이어질 수 있다. 효소의 활성과 관련이 있는 주요 요인으로 효소의 유연성을 꼽을 수 있다. 효소의 움직임은 잔기들의 진동과 더불어 국소적인 또는 전체적인 구조 변동에 의해 결정되는데, 이러한 움직임이 효소의 촉매 작용에 관여하고 있기 때문이다. 그러나 효소의 유연성 분석을 위한 방법이 많지 않고, 있다 해도 불확실하다. 이 연구에서는 효소가 기질 결합할 때 나타나는 유연성 변화를 분석하기 위하여 탄성체 모델 (elastic body model)을 제시하였다. 이 모델은 효소에 역학적 개념을 도입하여 효소의 잔기에 작용하는 힘과 토크(torque)를 해석하였다. 기질이 없는 구조와 붙어 있는 구조 두 상태에 후크의 법칙 (Hook`s law) F=-kx을 도입하여 효소의 잔기 힘을 구하였고, 이 힘 벡터(vector)의 합을 통하여 토크를 계산하였다. 이 모델을 입증하기 위하여 박테리오파아지 T4 리소자임 (bacteriophage T4 lysozyme), HIV-1 프로테아제 (HIV-1 protease), 칸디다 안타르카티카 리파아제 B (Candida antarctica lipase B)의 자료를 분석하였다. 효소 탄성체 모델은 효소의 움직임, 효소 반응의 저해, 이합체화에 중요한 여러 부위를 힘이 많이 걸리는 부위 혹은 구부러지는 부위로 찾아내었다. 특히 탄성체 모델 분석에서 힘이 걸린 부위와 박테리오파아지 T4 리소자임의 활성 증대 돌연변이체의 변이 부분에 겹치는 부분이 있다는 것을 확인하였다. 이 연구에서는 효소의 활성과 유연성 관계를 조사하기 위하여 보고된 박테리오파아지 T4 리소자임 돌연변이체들을 분석하였다. 박테리오파아지 T4 리소자임의 활성 증대 돌연변이체는 헬릭스 (helix) 구조의 끝에 변이가 일어난 경향성이 나타났으며, 유연성이 높은 아미노산인 글루타민산이나 아스파르트산으로 치환된 경향성이 나타났다. B-factor 분석 결과, 변이된 잔기들은 유연성이 증가한 것으로 나타났다. 효소 탄성체 모델을 이용하여 효소의 활성 증대 현상이 효소가 유연성을 띄게 변하여 증가된 움직임에 의한 것이라고 해석되었다. 힘이 걸린 부분에 유연성이 높은 아미노산을 도입하여 활성을 증대시키는 전략을 입증하기 위하여 산업적으로 유용한 효소인 칸디다 안타르크티카 리파아제 B를 선택하였다. 이 효소의 활성 부위를 둘러싸고 있는 지역에 변이를 일으켰을 때 활성이 높아졌다. 활성 부위를 둘러싸는 네 개의 헬릭스 끝 부분을 유연성이 높은 아미노산으로 바꾸었다. V139E와 I255E 두 개의 변이체가 p-니트로페닐 카프릴레이트 (p-nitrophenyl caprylate) 가수분해 반응에서 증가된 활성을 나타냈다. 탄성체 모델 분석에서 V139E를 포함하고 있는 힘이 높게 걸리는 헬릭스와 주변 루프 (loop) 139-150를 찾았고, 이 부분을 효소의 활성을 증대시키기 위한 다음 돌연변이 표적으로 삼았다. 힘이 걸린 잔기들을 유연성이 높은 아미노산으로 치환한 결과, 여덟 개의 표적 돌연변이체 중 V139S, A141E, V149S, A151D가 증대된 활성을 나타내었다. 또한 헬릭스 139-146이 더 유연하게 움직이게 하기 위하여 헬릭스 양쪽 끝에 글리신 잔기를 추가한 루프 연장 돌연변이체를 만들었다. 헬릭스 268-287과 맞닿아 있는 헬릭스 C-말단 쪽 A146의 연장이 활성을 증가시켰다. 이 결과는 효소의 의학 및 산업적인 응용시 효소의 유연성 조절을 통해 효소의 활성을 증가시킬 수 있는 가능성을 제시하였다.

Enzymes are essential biological molecules and widely used in industry. Therefore, investigating the underlying mechanisms how enzyme activity is changed by mutations may have widespread clinical and industrial applications. One major factor related with enzyme activity is enzyme flexibility because enzyme motion which reflects residual vibrations and conformational changes locally and globally is involved in its catalysis. However, the tool for enzyme flexibility analysis is few and incomplete. In this study, an elastic body model was proposed to analyze the flexibility changes of enzyme caused by substrate binding. This model adapted a mechanical concept to explain residual force and torque of enzyme. The residual forces were obtained using substrate-free and -bound structures of the enzymes by Hook`s law, F=-kx, and the torques were calculated by the summation of the force vectors. In order to validate this model, the data on bacteriophage T4 lysozyme, HIV-1 protease, and Candida antarctica lipase B were analyzed. Elastic body model pointed out several meaningful regions for enzyme motion, inhibition, and dimerization as high forced or bended regions. Specifically, the forced region from the elastic body model analysis overlapped with the mutated region of the activity-enhanced mutants of bacteriophage T4 lysozyme. In this study, various reported mutants of bacteriophage T4 lysozyme were analyzed to investigate the relationship between enzyme activity and flexibility. The activity-enhanced mutants of bacteriophage T4 lysozyme demonstrated a tendency for mutations to localize to the edge of helices and to involve substitutions to flexible amino acids such as glutamic acid and aspartic acid. Additionally, the mutated residues showed increased flexibility in B-factor analysis. Using elastic body model, the phenomena of activity increase was interpreted as increase of mobility when enzyme changed to be flexible. Candida antarctica lipase B, an industrially useful enzyme, was chosen to validate the strategy that introduction of flexible amino acids in forced region can enhance enzyme activity. The activity of C. antarctica lipase B was improved by mutation of the area surrounding the active site. The edges of four helices surrounding the active site were changed to flexible amino acids. Two mutants, V139E and I255E showed enhanced specific activity for p-nitrophenyl caprylate hydrolysis. The highly forced helix and near loop, 139-150, including residue V139 identified in elastic body model analysis was focused as next targets for mutagenesis to enhance enzyme activity. The forced residues were substituted to the flexible amino acids, and V139S, A141E, V149S and A151D showed enhanced activity among eight target mutations. The loop extended mutants by adding glycine in both edges of the helix 139-146 were created to provide more flexible helix motion. The extension in A146 which is the C-terminal edge of the helix in contact with the helix 268-287 resulted in activity enhancement. These findings suggest that flexibility modulation may be a feasible mean to enhance enzyme activity for clinical and industrial applications.