Meat species identification using loop-mediated isothermal amplification assay targeting species-specific mitochondrial DNA

Abstract

최근 일련의 식육불법 혼입 사건 등은 이와 같은 식육 불법 혼입을 정확히 판별해 낼 수 있는 과학적인 기법에 대한 소비자의 요구를 증가시켰다. 이러한 소비자의 요구를 충족시키고자 식육 감별을 위한 유전자증폭기법은 다양하게 개발 및 활용되어 왔다. 본 연구에서는 종 특이적 미토콘드리아 서열을 활용한 신속유전자등온증폭기법을 개발하여 소, 돼지, 말, 염소, 양, 닭, 오리, 칠면조 총 8종의 식육을 특이적으로 검출 및 감별하고자 하였다. 종 특이적 미토콘드리아 서열을 활용하여 LAMP 프라이머를 제작하여 각기 다른 annealing temperature가 설정되도록 하였고, LAMP 시약 내 intercalating dye를 첨가하여 반응산물의 증폭 및 분석을 실시간 관찰할 수 있도록 하였다. 각각의 LAMP기법별 최적 반응 온도 및 시약 조건을 설정하였고 8종의 식육을 3그룹으로 분류한 후 시험한 결과, 교차 반응 없이 모두 100%로 관찰되었으며 각 종마다 고유한 값을 나타내어 이를 토대로 그룹 내에서 특정 식육 종을 성공적으로 분류할 수 있었다. 개발된 LAMP기법을 원료육, 가열육, 혼합육, 혼합가열육 등 총 4개의 시료군에 적용하여 검출한계를 관찰하였다. 원료육 및 가열육에서의 LAMP 검출한계는 10 pg/μl to 100 fg/μl의 범위에서 관찰되었고, 혼합육 및 혼합가열육에서의 LAMP 검출한계는 0.01% to 0.0001%의범위에서관찰되었다. 또한, 실시간으로 관찰된 증폭산물을 토대로 30분 이내에 정량화 곡선을 도출할 수 있었기에 매우 신속하고 실시간 정량이 가능한 기법임을 알 수 있었다. 본 연구에서 개발한 LAMP기법은 신속성, 민감도, 정확도가 높은 유전자 분석 기법으로서 식육 종의 감별을 보다 쉽게 수행할 수 있을 것으로 기대되며, 향후 표준법과의 병행 활용 가치 또한 높을 것으로 기대된다.

Meat fraud and adulteration has led to consumer demands for accurate methods of meat source. LAMP assays targeting species-specific mitochondrial DNA were designed to identify and discriminate eight meat species based on annealing curve analysis: cattle, pig, horse, goat, sheep, chicken, duck, and turkey. The LAMP primer sets were designed on the basis of a consensus of several mitochondrial sequences for each species. No cross-reaction was observed and all eight species were successfully discriminated by their unique annealing temperatures. The limits of detection (LoDs) of the LAMP assays in raw and cooked meat were determined at 10 pg/µl to 100 fg/µl levels, and those in raw and cooked meat admixtures were determined at 0.01% to 0.0001% of target meat levels within 30 min. The newly designed LAMP assays are a simple, rapid, accurate, and sensitive method for discrimination of eight meat species and could be used for meat species identification.