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High-throughput single molecule identification and separation method using focused pulse laser system
펄스 레이저를 이용한 고속 단분자 식별 및 분리 기법

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Authors
이호원
Advisor
권성훈
Major
협동과정 나노과학기술전공
Issue Date
2013-08
Publisher
서울대학교 대학원
Keywords
Microarray DNAEncoded microparticlePulse laserNext generation sequencingCloning
Abstract
최근 합성생물학 분야의 가장 큰 화두는 ‘대량’이다. DNA를 대량으로 빠른 시간에 읽어내는 차세대 염기서열 분석 기술의 급격한 성장은 다양한 종의 주요 유전회로 정보를 밝혔으며 이는 새로운 기능의 염기 서열을 ‘쓰기’ 위한 유용한 단초를 제공해 주었다. 염기서열 ‘쓰기’ 기술은 단백질 공학, 합성 유전체 연구 및 새로운 생물학적 회로의 구성뿐만 아니라 DNA 메모리와 같은 다양한 차세대 분야에서 응용이 가능하여 그 중요성이 더해지고 있다. 일반적으로 염기서열 ‘쓰기’ 기술은 화학 합성 시 발생하는 오류로 인하여 충분한 길이의 염기 서열을 한번에 합성하는 것은 확률적으로 불가능하며 서열이 확인된 짧은 염기서열을 상향식으로 조립해 나가는 것이 합리적인 접근 방법이다. 따라서 저렴한 양질의 염기서열 재료를 대량으로 준비하는 것이 반드시 필요하다.

마이크로 어레이 DNA와 같은 최신의 합성 기술은 한 번에 수십만 종 이상의 짧은 염기서열을 합성할 수 있으나 오류가 섞여 있으며 원천적으로 혼합되어 있어 목적 염기서열로 조립하는데 사용하기 위해서는 적절한 대량의 식별 및 분리기법이 수반되어야 한다. 본 논문에서는 미세 입자 기술, 펄스 레이저 기술 및 위치추적 알고리즘 기술을 기반으로 차세대 염기서열 분석 장비를 통해 병렬적으로 분석된 수백만 개의 단분자 클론을 고속으로 분리하여 직접 사용하게 함으로써 마이크로어레이 칩 DNA의 효용성을 극대화 하는 기술을 소개한다

특정 탐침으로 표면이 기능화된 미세입자는 3차원 액상에 존재하는 혼합된 염기서열 집단으로부터 목적 염기서열만을 탐침과의 혼성화를 통해 분리한다. 코드화된 미세 입자는 혼성화 이후 펄스 레이저의 광압을 이용하여 물리적으로 분리하여 사용하도록 한다. 그러나 미세입자를 이용한 분리 기법은 동시에 여러 종류의 목적 염기서열을 3차원 반응상에서 분리할 수 있다는 장점에도 불구하고 목적 서열에 따라 개별적으로 미세입자를 준비해야 한다는 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하기 위하여 DNA 마이크로 어레이의 탐침 영역을 펄스레이저 식각 기술을 응용하여 직접 분리하는 기술을 제시한다. DNA 마이크로 어레이는 한 번에 수십만 종 이상의 탐침영역을 표면에 기능화시킬 수 있으며 혼성화 반응을 통해 병렬적으로 혼합된 염기서열 집단을 분리할 수 있어 효율적이다. 다만 기판으로부터 물리적으로 분리하는 방법의 부재로 인하여 관찰의 용도로만 사용하여 왔다. 본 논문에서 제안한 펄스레이저 식각 기술은 탐침 및 탐침과 혼성화 분리된 목적 염기서열을 포함하는 기판영역 전체를 물리적으로 분리할 수 있도록 하여 ‘쓰기’의 재료로 이용 가능하게 한다.

한편 탐침 서열로 혼성화 하여 분리된 목적 염기서열들은 합성할 때 발생한 오류를 가지는 서열을 그대로 지니고 있다. 정확한 목적 염기서열만을 분리하기 위하여 전통적으로 클로닝 기법이 사용되는데 이는 근본적으로 무작위 추출 및 뒤따르는 개별 염기서열 분석을 기반으로 하고 있어 효율적이지 못하다. 본 논문에서 제안하는 ‘Sniper cloning’ 기법은 펄스레이저 광압 분리 기술과 정교한 위치추적 알고리즘을 바탕으로 차세대 염기서열 분석장치를 이용하여 사전 검열된 막대한 양의 클론 미세입자들로부터 목적 염기서열을 고속 비 접촉 방식기술을 이용하여 선택적으로 분리하여 무작위 추출로 인해 발생하는 불필요한 노동력과 비용을 제거하였으며 매우 높은 순도의 전구 염기서열을 대량으로 생산한다.

본 논문에서는 염기서열 ‘쓰기’ 기술이 가지는 잠재적 발전 가능성과 이를 뒷받침 하기 위해 개발된 다양한 기반기술에 대하여 소개하고자 한다.
The key challenge of synthetic biology currently lies in the absence of cost effective high standard oligonucleotide precursor for constructing target long sequence. Microarray DNA is an ultra-rich source of oligonucleotides that generates millions of short oligonucleotide sequence in a single run. In spite of ensuring overwhelming advantages over conventional chemical oligonucleotide synthesis, the efficiency of the progress is dogged by high complexity and low quality of microarray DNA. In this thesis, I present various techniques including encoded-microparticle, DNA microarray and pulse laser sniper cloning, for the improvement of preparative tool for ‘writing’ DNA.
In the first part of this thesis, an important state-of-the-art element technologies for writing DNA are reviewed. Microarray DNA technology offers millions of short DNA in a cost effective single run that overcomes the problems related with conventional one-by-one column synthetic approach. Meanwhile, the downstream separation and the identification steps which normally consist a vector cloning and Sanger sequencing can also be replaced by high-throughput Next Generation Sequencing (NGS) platform. This chapter concludes in discussing the developmental possibility of a next generation writing technology by closely combining the elemental technologies into a preparative tool.
The second part provides an overview to the fabrication method of various microparticles for complex pool separation. The microparticles which possess distinctive IDs and probe oligonucleotides on their surfaces plays a floating microfilter that selectively separates the target single strand DNA from complex pool according to the probe sequence. The fabrication of color barcoded microparticle and magnetochromatic sphere based on optofluidic technique is described followed by simple demonstration of DNA separation.
Third part describes the pulse laser driven microstructure techniques. The focused nanosecond pulse laser exerts radiation pressure onto the microparticles containing hybridization selected DNA from mixed pool. Furthermore, the target microparticles can be physically separated without actual physical contact. More condensed energy of focused pulse laser ablates target substrate and therefore, generates a small explosion. The separated contents of an array of probe spots such as DNA microarray is also able to be individualized for utilization by directly ablation of target containing substrate.
Chapter 4 presents the development of ‘clone sniper’ method using parallel identification followed by high-throughput separation approach to construct ultra-high quality oligonucleotide library with low cost and high-throughput. This approach reduces the labor intensive conventional clonal separation and expensive Sanger derived identification. The custom made pulse laser retrieval system enables non-contact contamination high-throughput separation of perfect parts from sequencing plate with precise position data constructed by local mapping algorithm. The serial process consists of parallel synthesis parallel identification and high-throughput separation which not only increases the quality of contents, but also dramatically reduces the necessary resources, such as
cost, labor and time.
Chapter 5 provides a very compact summary of this research work, highlights the contributions made. Possibilities for future work to increase the significance of the approaches discussed.
Language
English
URI
http://hdl.handle.net/10371/135036
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College of Engineering/Engineering Practice School (공과대학/대학원)Nano-Science and Technology (협동과정 나노과학·기술전공)Theses (Ph.D. / Sc.D._협동과정 나노과학·기술전공)
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