Hyaluronic Acid Nanocomposite Hydrogels via In situ Precipitation Process for Biomedical Applications

Abstract

조직공학에서는 생체 내 조직과 환경이 유사한 입체 구조의 하이드로젤이 각광받고 있는데 그 중에서도 높은 강도, 여러 자극 감응형, 약물 및 생체인자 전달 등 다양한 기능성을 부여하기 위하여 하이드로젤에 고분자 뿐 아니라 금속 혹은 세라믹 입자를 혼합하여 복합 하이드로젤을 만드는 연구가 많이 진행되고 있다. 나노 크기의 금속 혹은 세라믹입자로 이루어져 있는 복합 하이드로젤의 경우, 대표적인 제작방법으로는 가교시키기 전의 고분자 혹은 단량체 용액에 입자들을 물리적으로 교반하는 방법이 있다. 하지만, 나노 크기의 입자를 용액 내에 고르게 분산시키는 것이 어려울 뿐 아니라, 입자들끼리 뭉치는 양상을 보이기도 한다. 뿐만 아니라 이러한 입자들이 젤화가 이루어지는 동안 가라앉아 균일한 구조를 제작하는데 어려움이 있다. 이를 해결하기 위해서, 입자들의 표면처리나 젤의 구성성분이 될 고분자의 화학적 처리 등 추가적인 반응이 필요하다. 이를 해결하기 위하여, 기본적으로 높은 팽윤 특성을 지니고 있는 하이드로젤의 기본특성을 이용하여 복합 하이드로젤을 제작하였다. 하이드로젤 내부에 이온을 확산시킨 후, pH 변화 등으로 인한 석출과정을 거쳐 젤 내부에 입자들을 고르게 석출시켜 복합 하이드로젤을 제작하였다.

본 논문은 생체적합성이 우수한 히알루론산 하이드로젤 내부에 대표적인 생체세라믹에 해당하는 인산칼슘을 나노사이즈로 석출시켜 기존 복합 하이드로젤보다 기계적 물성 및 분해저항성, 그리고 생체활성 등을 향상시키는 연구에 대해 다루었다. 인산칼슘의 전구체에 해당하는 염화칼슘과 인산용액에 히알루론산 하이드로젤을 담가 이온들이 내부로 확산되게 한 후, 수산화암모늄으로 인산칼슘을 석출시켰다. 이러한 석출법을 통하여 얻은 복합 하이드로젤의 미세구조 및 조성, 인산칼슘의 크기 및 조성, 분포도 등을 구체적으로 분석하였다. 전구체 용액의 농도를 조절함으로써 석출되는 인산칼슘의 조성을 다양하게 조절할 수 있었고, 이로 인해 복합 하이드로젤의 습윤능력, 유변학적 물성, 효소에 의한 분해 정도 등 다양한 물성 또한 조절이 가능한 것으로 보였다. 또한, 기존 교반 방법으로 만든 복합 하이드로젤보다 우수한 유변학적 물성을 띠는 양상에 대하여, 기존에 알려져 있는 젤의 구조와 물성 간의 관계에 대한 모델을 이용하여 히알루론산 고분자 부분과 인산칼슘 나노입자의 상호작용의 차이를 도출하였다. 그리고 석출법을 통한 복합 하이드로젤의 우수한 생체저항성을 히알루로나아제 효소 용액 내 및 동물실험을 통하여 평가한 결과, 순수 히알루론산 하이드로젤에 비해 저항속도가 현저하게 낮아졌음을 확인하였다. 기존 방법으로 제작한 복합 하이드로젤에 비해서도 우수한 생체저항성을 나타내었다. 마지막으로 섬유아세포의 부착정도 및 증식평가, 그리고 동물실험을 통하여 인산칼슘 혼합으로 인하여 복합 하이드로젤의 생체활성이 향상되었음을 확인하였다. 우수한 기계적 물성 및 생체활성을 나타내는 복합 하이드로젤을 주입형 필러 및 하이드로젤 창상재료로의 응용가능성을 평가하였다. 우선, 주입형 필러로 적용하기 위하여 위에서 연구한 복합 하이드로젤을 분쇄하였는데, 이 과정에서 균일한 인산칼슘 나노입자가 히알루론산 하이드로젤 표면에 고르게 분산된 구조적 형태가 유지됨을 확인하였다. 분쇄된 젤 형태를 앞서 분석한 대로 특성평가 및 유변학적 물성을 평가하였다. 더 나아가 나노 입자 형태의 인산칼슘을 포함한 이 복합 하이드로젤이 마이크로입자의 인산칼슘이 교반된 형태의 복합 하이드로젤보다 다양한 면에서 우수성을 나타내었다. 나노 복합체가 마이크로 복합체보다 유변학적으로 더 단단한 거동을 보였고 이로 인하여 쥐 피부에 주입하여 볼륨 유지능을 평가한 결과, 나노 복합체가 마이크로 복합체보다 더 오랜 기간동안 큰 부피로 유지하는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라, 나노 복합체가 마이크로 복합체보다 균일도가 뛰어나 생체활성 면에서도 훨씬 향상된 양상을 보였다. 이 나노 복합체 필러가 실제 주름개선에도 효과가 있는지 평가하기 위하여, 광노화 과정을 통하여 생긴 쥐 주름 부위에 필러를 주입하여 주름개선효과 및 피부조직 재생 정도 등을 심도있게 분석하였다. 순수 히알루론산 필러보다 훨씬 우수한 주름개선효과를 보였는데, 이는 앞서 보였던 나노 복합체 필러의 향상된 기계적 물성뿐 아니라, 체내 세포 및 조직 재생을 돕는 인산칼슘의 영향으로 인한 결과라는 점을 확인할 수 있었다. 마지막으로, 우수한 상처치유능과 항균효과를 가진 복합 하이드로젤 재료를 제작하기 위하여, 위에서 연구한 석출법을 이용하여 인산칼슘 이외에 플루오린화 칼슘을 하이드로젤 내부에 석출시켰다. pH 변화 없이 빠른 속도로 플루오린화 칼슘입자를 석출이 가능하였고, 석출된 입자들의 결정성이 높아 복합 하이드로젤을 생리학적 용액에 담갔을 때 ppm 단위 수준의 플루오린 이온을 방출시킬 수 있었다. 석출시간을 조절하여 이온 방출거동 또한 조절이 가능하였다. 방출된 플루오린 이온은 세포독성에 영향을 거의 미치지 않고, 오히려 우수한 생체활성을 띠었다. 섬유아세포의 부착정도 및 증식 정도가 순수 히알루론산 기반 하이드로젤 위에서보다 훨씬 증가하였을 뿐 아니라 혈관내피세포의 이동을 촉진시킴으로써 플루오린화 칼슘이 내포된 복합 하이드로젤의 우수한 상처치유능을 알 수 있었다. 또한, 방출된 플루오린 이온으로 인하여 대장균 및 황색포도상구균의 증식을 억제시켜 항균효과를 지닌 것을 확인하였다. 전층 피부결손 동물모델을 이용하여 복합 하이드로젤의 상처 치유정도 및 주변 조직 재생 정도를 평가한 결과, 아무 처리하지 않은 상처는 물론 순수 히알루론산 기반 하이드로젤보다 더 빠른 속도로 상처가 치유되었을 뿐 아니라 상처 주위 표피 및 진피 재생을 효과적으로 촉진시킨 점을 조직학적으로 평가하였다. 이로써, 본 연구에서는 석출법을 통하여 균일하고 우수한 물성을 지닌 히알루론산 기반 세라믹입자의 복합 하이드로젤을 다양하게 제작할 수 있었고, 이를 실제 주입형 필러 및 창상치유재료 등 연조직재생 스캐폴드로의 응용가능성을 평가하였다. 더 나아가 석출입자의 조성을 조절하여 연조직뿐 아니라 경조직용 스캐폴드로써의 연구뿐 아니라, 하이드로젤 내부에서 석출 정도를 달리함으로써 다중상 스캐폴드로의 제작 등으로 활용 및 연구범위를 넓힐 수 있을 것으로 기대된다.

Hyaluronic acid (HAc) hydrogels offer many advantages as tissue engineering scaffolds, including excellent biocompatibility and biodegradability. However, these hydrogels have limited biomedical applications because of their poor biomechanical properties and rapid enzymatic degradation. Thus, it is essential to understand the effect of modifying the chemical structure of HAc via crosslinking reactions or of fabricating nanocomposite systems on the properties of the resulting hydrogels. In this work, we developed an in situ precipitation process to fabricate HAc–calcium phosphate (CaP) nanocomposite hydrogels after the formation of glycidyl methacrylate-conjugated HAc hydrogels via photo-crosslinking to improve the mechanical and biological properties of HAc hydrogels. Our process facilitates the rapid incorporation of CaP nanoparticles with excellent uniformity and minimal agglomeration into a polymer matrix. We systematically compared our nanocomposite system with one fabricated using simple mixing based on the relationship between the hydrogel structure and rheological properties. Compared with pure HAc, the nanocomposite hydrogels showed improvement of not only the mechanical behavior but also the biostability under both in vitro and in vivo conditions. In addition, we demonstrate two potential applications of HAc-based nanocomposite hydrogels as injectable dermal fillers and wound dressing materials. To evaluate the potential of the hydrogels for dermal filler applications, HAc–hydroxyapatite nanocomposite (HAc–nanoHAp) hydrogel fillers were prepared in particulated gel forms, and their properties were compared with those of pure HAp hydrogel fillers. Their rheological behavior, in vivo lateral diffusion under mouse skin, and effect on wrinkle improvement in a photo-aged mouse model were evaluated. The HAc–nanoHAp filler resulted in great improvement of the wrinkles because of its higher stiffness and gel cohesiveness compared with those of pure HAc. The strength of the dermal matrix was also greatly enhanced using HAc–nanoHAp, as it stimulated the synthesis of extracellular matrix such as collagen and elastin fibers. Thus, the HAc–nanoHAp filler shows great potential as a soft tissue augmentation product by improving the biophysical and biological performance of skin tissue. To evaluate the potential of the hydrogels for wound dressing applications, another nanocomposite hydrogel containing calcium fluoride (CaF2) was introduced. CaF2 particles, which are known to exhibit good antibacterial activity, were uniformly embedded within the HAc-based hydrogel using the in situ precipitation process. By varying the concentrations of the CaCl2 and NH4F solutions as well as the precipitation time, we obtained hydrogels with different morphologies of CaF2 particles and different ion-release profiles. Colony tests and live/dead assays using Escherichia coli and Staphylococcus aureus were employed to evaluate the antibacterial capabilities of the CaF2 composite hydrogels. Regardless of the bacteria type, a significantly lower density of bacteria was observed on the CaF2 nanocomposite hydrogels. In addition to their good antibacterial effect, improvement of cellular responses such as cell attachment and proliferation were also achieved for the CaF2 nanocomposite hydrogels. Furthermore, the excellent wound healing efficiency of these nanocomposite hydrogels was demonstrated using an in vitro cell migration assay. Finally, the accelerated wound healing capability of the CaF2 nanocomposite hydrogels was demonstrated by examining the wound closure changes over time using a full-thickness wound in a rat model compared with those for the pure hydrogel. Based on our findings, the CaF2 nanocomposite hydrogel shows great potential for application as an advanced hydrogel wound dressing with both antibacterial and accelerated wound healing effects.