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A Study on the Heterologous Expression of Nonactin Biosynthetic Gene Cluster Ortholog in Streptomyces albus J1074 : 방선균 유래 Nonactin 생합성 상동유전자의 이종숙주발현에 관한 연구

DC Field Value Language
dc.contributor.advisor오기봉-
dc.contributor.author박완기-
dc.date.accessioned2017-10-27T16:49:20Z-
dc.date.available2017-10-27T16:49:20Z-
dc.date.issued2017-08-
dc.identifier.other000000145282-
dc.identifier.urihttps://hdl.handle.net/10371/136889-
dc.description학위논문 (박사)-- 서울대학교 대학원 농업생명과학대학 농생명공학부, 2017. 8. 오기봉.-
dc.description.abstract방선균은 자연에 널리 존재하는 미생물로써 항생제, 항곰팡이제 그리고 항암제 같은 유용한 생리활성물질을 만든다. 최근, 해양에서 유래한 방선균에 대한 연구가 많이 이루어지고 있는데 해양생태계는 육상생태계와는 생존환경이 많이 다름으로 특이한 구조의 2차대사물질을 만든다고 알려져있다. 해양에서 유래한 방선균으로부터 새로운 2차대사물질을 찾기위해, 마이크로네시아의 해양 침적물에서 Streptomyces puniceus MBL39 라고 명명한 방선균을 분리했고, 또한 한국해양연구원으로 부터 Streptomyces puniceus Act1085 라는 방선균을 분양 받았다. 두 방선균의 16S rRNA 유전자 서열과 형태적 특징을 분석한 결과, 두 방선균은 동일한 균주라는 것이 밝혀졌다. S. puniceus Act1085 에서는 Dimeric dinactin과 Cyclo-homononactic acid 라는 두 개의 nonactin 유도체가 발견되어, S. puniceus Act1085 는 아마도 nonactin biosynthetic gene cluster 와 매우 유사하면서도 크기는 좀 작은 biosynthetic gene cluster 을 가지고 있을 것이라고 예측하였다. 따라서, S. puniceus Act1085 가 예측한대로 그러한 biosynthetic gene cluster 을 지니고 있는 지 확인하기 위하여, S. puniceus Act1085 의 genomic library 을 제조하고, 적절한 probe로 screening 을 수행하였다. S. puniceus Act1085 에서 찾아낸 biosynthetic gene cluster 의 ORF 들을 nonactin biosynthetic gene cluster 의 ORF 들과 비교한 결과 아미노산 서열의 상동성이 82%에서 96%로 매우 높았다. S. puniceus Act1085 에서 찾아낸 biosynthetic gene cluster 을 이종숙주인 Streptomyces albus J1074 에 heterologous expression을 수행하면서, 새로운 nonactin 유도체가 만들어 질 것이라는 예상을 하였으나, nocardamine 이 생산되었다. 추가적인 heterologous expression 실험을 통해, S. albus J1074 에서 nocardamine 의 생산은 S. puniceus Act1085 에서 유래한 nonG ortholog 의 작용에 의한 것이라고 판단된다.-
dc.description.tableofcontentsINTRODUCTION 1
Actinomycetes 1
Streptomyces 10
Marine natural products 13
Cryptic/silent biosynthetic gene clusters in actinomycetes 24
The purpose of this study 29

MATERIALS AND METHODS 31
Bacterial strains 31
Identification of Streptomyces sp. Act1085 and Streptomyces sp. MBL39 31
Culture conditions for Streptomyces sp. Act1085 (=MBL39) and Streptomyces albus J1074 33
TLC-bioautography overlay assay 33
Genomic DNA isolation 34
Partial digestion and size fractionation of Streptomyces sp. Act1085 (=MBL39) genomic DNA 34
Digestion of the cosmid vector pOJ446 and ligation of insert genomic DNA to vector pOJ446 35
In vitro packing reaction 38
Library screening 41
Subcloning of 26 kb fragment 42
Total RNA isolation 45
Reverse transcription-polymerase chain reaction 46
Production and analysis of compound 47
Subcloning of 16 kb fragment 48
Subcloning of 10 kb fragment 48
Subcloning of nonB and nonG ortholog 49

RESULTS 50
Strains and antimicrobial test 50
Strains 50
Antimicrobial test 56
Identification of Streptomyces sp. Act1085 and Streptomyces sp. MBL39 by 16S rRNA gene sequence analysis 59
Construction of Streptomyces puniceus Act1085 genomic library 62
Screening of the cosmid library and ORFs analysis 68
Subcloning of 26 kb fragment 82
Transformation of pUWL201PW and pXH26 85
Reverse transcription-polymerase chain reaction of transformants 88
S. albus J1074 (pXH26) transformants production and analysis of compound 91
Subcloning of 16 kb and 10 kb 109
S. albus J1074 (pXH16) and S. albus J1074 (pXH10) transformants production 118
Confirmation of nocardamine production regulator in nonactin biosynthetic gene cluster 121
Reverse transcription-polymerase chain reaction for nocardamine biosynthetic genes expression
in S. albus J1074 127

DISCUSSION 130
REFERENCES 139
SUPPLEMENTARY MATERIALS 147
ABSTRACT IN KOREAN 153
PUBLICATION 155
-
dc.formatapplication/pdf-
dc.format.extent5555023 bytes-
dc.format.mediumapplication/pdf-
dc.language.isoen-
dc.publisher서울대학교 대학원-
dc.subjectSecondary metabolites-
dc.subjectStreptomyces puniceus-
dc.subjectSilent biosynthetic gene clusters-
dc.subjectNonactin-
dc.subjectHeterologous expression-
dc.subjectNocardamine-
dc.subjectStreptomyces albus J1074-
dc.subject.ddc630-
dc.titleA Study on the Heterologous Expression of Nonactin Biosynthetic Gene Cluster Ortholog in Streptomyces albus J1074-
dc.title.alternative방선균 유래 Nonactin 생합성 상동유전자의 이종숙주발현에 관한 연구-
dc.typeThesis-
dc.description.degreeDoctor-
dc.contributor.affiliation농업생명과학대학 농생명공학부-
dc.date.awarded2017-08-
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College of Agriculture and Life Sciences (농업생명과학대학)Dept. of Agricultural Biotechnology (농생명공학부)Theses (Ph.D. / Sc.D._농생명공학부)
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