소 배아유래 전분화능 줄기세포의 생산 및 분석

Abstract

배아줄기세포는 자가증식능력과 모든 세포로 분화할 수 있는 전분화능을 가지고 있다. 이러한 두 가지 특징 때문에 배아줄기세포는 동물 및 사람의 다양한 기초연구에 활용되고 있다. 오랫동안 소에서도 배아줄기세포를 생산하기 위한 노력이 있었으나, 진정한 의미의 배아줄기세포는 아직까지 보고된 바 없다. 본 연구에서는 소분자물질을 포함하는 배양액을 통해 소 배아줄기세포를 확립하고 다양한 분자생물학적 기법을 통해 그 성상을 분석하였다. 이러한 연구를 위해 먼저 배아줄기세포 생산에 적합한 소분자물질을 선별하고 증식력, 전능성 마커 및 분화능 검증을 포함하는 전분화능 줄기세포의 지표를 통해 배양된 세포의 성상을 분석하였다. 마이크로어레이를 통해 전사체 분석을 실시하였으며 관련된 차별발현유전자는 Real-time PCR기법을 통해 검증하였다. 또한 전분화능 관련 신호경로는 KEGG분석을 이용하였다. 생산된 배아줄기세포는 단층의 평평한 형태를 보였으며 alkaline phosphatase 염색에 양성을 보였다. 또한 배양된 세포는 정상적인 핵형 및 전분화능 유전자발현을 보이며 50계대 이상 증식이 유지되었다. 비록 불완전한 체내분화능 때문에 유사배아줄기세포로 정의하였지만, 생산된 세포내부에 Cdx2의 발현없이 Oct4 또는 Nanog 유전자 만 발현하는 전분화능 세포집단의 존재를 확인하였다. 전분화능을 향상시키기 위해 티아조비빈을 처리한 결과 배반포 부착 및 계대 후 증식력이 유의적인 차이를 보이며 증가하는 것을 확인하였다. 또한 전분화능 및 E-cadherin 유전자발현 역시 티아조비빈을 처리한 실험군에서 증가하였으나 여전히 체내분화능을 향상시키는 데는 실패하였다. 유사줄기세포의 한계를 분석하기 위해 마이크로어레이 분석을 진행하였다. 암과 관련된 유전자분석결과 발암유전자는 감소하고 항암유전자는 증가하였다. 이러한 결과는 배양된 줄기세포의 체내분화능이 약화된 원인과 관련이 있을 것으로 생각된다. 또한 TGFβ, WNT 그리고 LIF 신호경로가 소 전분화능 유지와 밀접한 관련이 있는 것으로 확인되었다. 다른 두 신호경로와 달리 LIF 신호경로는 비활성화 되어있어 LIF 신호경로의 재활성이 완전한 전분화능 획득에 중요한 역할을 할 것으로 생각된다. 결론적으로 본 연구에서는 세가지 억제제를 이용해 유사배아줄기세포를 생산하였다. 또한 세포의 성상을 검증하는 동안 소 전분화능 유지 한계의 원인을 규명하였다. 이러한 결과는, 소에서 특징적으로 나타나는 전분화능에 대한 이해를 넓히고, 나아가 대동물 유래 배아줄기세포 확립에 큰 도움을 줄 것으로 생각된다.