Cloning of the Gyeong-ju Donggyeong dog using trypsin-treated cells during the primary culture

Abstract

체세포핵이식은 동물의 유전적 정보의 유지에 유용한 기술로 생각 되며 멸종 위기 동물의 종 보존에 있어 응용이 가능 한 것 또한 입증되었다. 경주개 동경이는 2012년 천연기념물로 지정 되었으며, 개과 천연기념물 중 가장 오래된 역사를 가지고 있다. 그러나 유전적으로 가치가 있는 동경이는 일제강점기서부터 개체수가 급속도로 감소 하였다. 최근에는 약 400여마리만이 경주 지역에 서식하고 있으며 지속적인 개체관리가 필요로 하여 진다. 이러한 천연기념물을 멸종으로부터 보호하고 순수혈통을 보존하는 것이 필수적이다. 체세포핵이식에 있어 일차배양은 세포주 확립에 있어 필수적인 단계이다. 그러나 멸종위기종의 경우 일차배양에 필요로 하는 조직을 회수 하는 것에 어려움이 있다. 그러므로 한정적인 양의 조직으로 많은 양의 체세포를 확보하는 일차 배양 방법을 확립 하는 것이 필요하다. 트립신은 일차배양시 체세포를 빠르게 회수 하기 위해 널리 이용되고 있다. 그러나 트립신이 일차배양에 미치는 영향과 일차배양시 트립신을 처리한 세포를 이용하여 체세포핵이식을 진행했을 경우 체세포핵이식 효율에 미치는 영향에 관한 연구가 많이 진행되어 있지 않다. 일차 배양시 트립신을 처리하는 것이 미치는 영향을 알아보기 위해, 본 연구에서는 일차배양시 트립신을 처리하지 않은 비 처리군과 트립신 처리군 간의 확립된 세포수, 세포 생존능, 세포사와 세포 성장관련 유전자의 발현 정도 그리고 두 군의 세포를 이용하여 생산한 복제 배아의 체내 발달 여부를 비교 하였다. 일차배양시 트립신을 처리한 공여 세포주 (트립신 처리군)를 확립하기 위해서 배양 전의 피부 조직 조각을 0.25% 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산과 함께 1시간간 37 °C 에서 처리하였고 다른 군은 처리하지 않았다 (비 처리군). 결과적으로 같은 기간 동안의 일차 배양시, 트립신을 처리하는 것이 많은 세포가 확립되는 경향을 보였다. 그러나 트립신 처리군과 비처리군 사이의 세포 생존능과 세포사 관련 유전자의 발현 정도의 차이는 없었다. 세포 성장 관련 유전자 발현 정도는 트립신 처리군이 비 처리군에 비해 유의적으로 높은 PHB의 별현과 유의적으로 낮은 Akt1의 발현을 보였다. 위의 실험에 사용한 세 쌍의 비 처리군과 트립신 처리군 중 한 쌍의 비 처리군과 트립신 처리군 세포를 체세포핵이식 과정에 사용 하여 복제 효율을 비교하였다. 트립신 처리군은 90개의 복제 배아가 여섯 마리의 대리모에 이식 되었고 비처리군의 경우 71개의 복제 배아가 여섯마리의 대리모에 이식 되었다. 각 그룹 모두 3마리씩의 대리모가 임신이 확인되었고 (비 처리군

50.0% 대 트립신 처리군

60.0%), 각 그룹 4마리씩의 산자가 태어났다 (비 처리군

4.4% 대 트립신 처리군

5.6%). 이전의 실험 결과를 토대로 동경이의 세포주 확립을 위한 일차 배양시 피부 조직을 트립신에 처리하였다. 확립된 세포를 이용하여 체세포핵이식을 진행하였고, 총 42개의 복제 배아를 세마리의 대리모에 이식하였다. 한 마리의 대리모가 임신한 것이 확인되었고 (33.3%) 한 마리의 동경이가 제왕절개로 태어났다 (2.3%). 복제된 동경이는 세포공여 동경이와 유전적으로 동일하였으며, 동경이의 특별한 특징 중 하나인 단미를 가지고 있었다. 결론적으로, 일차 배양시 트립신을 처리 하는 것은 세포의 생존능과 세포사 관련 유전자의 발현 정도, 개의 체세포핵이식 효율에 영향을 주지 않았고, 이 방법은 비 처리 방법과 비교 하였을 때 증가된 세포 수를 보이는 추세였다. 본 연구는 최초로 천연기념물 경주개 동경이의 복제에 성공 하였고, 동경이의 특유의 짧은 꼬리 길이가 체세포핵이식을 통하여 보존 된다는 것을 증명하였다.

Somatic cell nuclear transfer (SCNT) has been considered as a useful tool to maintain genetic information of animals and it has demonstrated their potential application for conserving endangered animals. Gyeong-ju Donggyeong dog, a natural monument in Korea since 2012, has the oldest history among the Korea natural monument breeds. However, the number of this genetically valuable breed had been reduced gradually from period of Japanese occupation. Recently, it is reported that only about four hundred individuals is remained in Gyeong-ju and this breed is classified as endangered. Therefore, it is essential to save this natural monument breed from extinction and maintain a pure descent. Primary culture is the most basic and essential procedure to establish donor cells needed for SCNT. However, in case of endangered animals there is a difficulty about obtaining tissues, which must be required for primary culture. Thus, it is necessary to construct the primary culture method which can secure a large number of somatic cells with the given quantity of tissue. Trypsin has been widely used in primary cultures to rapidly harvest large numbers of cells. However, there are few studies on the effects of trypsin treatment on primary culture and canine SCNT efficiency using trypsin-treated cells. To investigate the effect of trypsin treatment on primary culture, I compared harvested cell numbers, cell viability, transcript levels of cell apoptosis-related and growth-related genes and in vivo embryo development after SCNT between a control (trypsin non-treated) group and a trypsin-treated group. To establish the trypsin-treated donor cell line (trypsin-treated group), Minced skin tissue was treated with 0.25% (w/v) trypsin ethylenediamine tetra-acetic acid (EDTA) at 37 °C for 1 h before seeded and another was non-treated (control group). As a result, compared to the control group trypsin treatment in primary culture had a trend (P = 0.14) to isolate more numbers of somatic cells in the same period. However, there was no significant difference in cell viability and expression of Bax/Bcl2 ratios between control and trypsin treated groups. In regard to transcript levels of cell growth-related genes, the trypsin-treated group contained significantly higher PHB transcript levels, but it showed significantly lower Akt1 transcript levels compared to the control group. Among the three pairs (each consisting of control and trypsin treated groups) of cell lines, which were used in the above experiments, one pair of the control and trypsin treated cell line was used for SCNT to compare the cloning efficiency. A total of 90 of cloned embryos derived from the control group were transferred to six recipients and 71 cloned embryos derived from trypsin-treated group were transferred to five recipient dogs. In each group, three surrogate mothers became pregnant (control group, 50.0%

trypsin-treated group, 60.0%) and delivered four pups (control group, 4.4%

trypsin-treated group, 5.6%). Based on these results, trypsin was treated during the primary culture procedure to establish a Donggyeong dog cell line. The Donggyeong dog cells-were used for SCNT and a total 42 cloned embryos were transferred to three recipient dogs. One surrogate mother got pregnant (33.3%) and one cloned Donggyeong dog was delivered by caesarean section (2.3%). The cloned Donggyeong dog was genetically identical with the donor Donggyeong dog and also had a short-tail which is one of the specific characteristics of Donggyeong dogs. In conclusion, trypsin treatment in primary culture did not affect cell viability, expression of Bax/Bcl2 ratio and canine cloning efficiency and this method tended (P = 0.14) to increase the cell number compared to the control method. The present study demonstrated for the first time the successful production of cloned Gyeong-ju Donggyeong dog by nuclear transfer using donor cells derived from trypsin-treated primary culture method. In addition, I demonstrated that the unique phenotype of the Donggyeong dog could be conserved by SCNT.