Carboplatin 내성 망막모세포종 세포주의 확립 및 특성 규명 연구

Abstract

서론: 망막모세포종(retinoblastoma)은 어린이에게 발병되는 안구내 악성 종양이다. 국소 치료와 항암화학요법을 사용하여 생존율을 높이고 안구를 보존하고 있다. 항암화학요법은 초기에 높은 효과를 나타낸다. 하지만 항암제에 저항성이 있는 세포로 인해 재발을 하는 경우가 생긴다. 그러한 환자는 다시 항암화학요법의 효과를 얻지 못하고 결국 안구를 적출하게 된다. 이러한 아이들의 안구를 치료하고 보존해 주기 위해 많은 연구가 필요한 실정이다. 본 연구에서는 항암화학요법에 저항성을 가진 세포를 확립하고 그 특성을 확인하고자 한다. 방법: 망막모세포종 세포주 Y79 및 SNUOT-Rb1에서 항암화학요법에 가장 많이 사용하는 carboplatin의 농도를 단계적으로 높여 처리함으로써 저항성 세포주를 확립했다. Carboplatin에 대한 내성을 확인하기 위해, 세포 생존 분석을 진행하였다. 또 carboplatin을 처리 후 세포에서 DNA 단편화 현상 확인 및 cleaved caspase-3 의 발현 정도를 확인하였다. BALB/c nude 생쥐 안구 안에 종양을 형성시킨 후 carboplatin을 주사하여 변화되는 양상을 확인하였다. 형광 활성 세포 분류기와 western blot을 통해 세포 주기를 확인하였고, 실시간 중합효소연쇄반응(quantitative real time polymerase chain reaction)을 통해 약물 유출에 관여하는 유전자의 변화를 확인하였다. 결과: 내성 세포주 Y79/CBP 및 SNUOT-Rb1/CBP를 확립하였다. 실제 세포 생존 분석에서 Y79/CBP 및 SNUOT-Rb1/CBP 세포주가 부모 세포에 비해 carboplatin에 대한 내성이 증가되어 고농도에서도 세포가 살아있음을 확인했다. 세포 사멸 실험인 DNA 단편화 현상 확인 및 cleaved caspase-3의 발현 평가에서도 carboplatin을 고농도로 처리하더라도 세포가 살아있음을 확인했다. 또 부모 세포와 carboplatin 내성 세포를 각각 안구내로 주입하여 종양을 형성시킨 뒤 carboplatin을 다시 안구내로 주사하였다. 종양의 크기를 비교 분석한 결과 내성 세포주가 부모 세포보다 더욱 종양이 잘 형성되는 결과를 확인하였다. 흥미롭게도 내성 세포의 성장속도가 부모세포보다 느리게 자라는 것을 확인하였다. 형광 활성 세포 분류기를 통해 세포 주기를 확인한 결과 G0/G1 세포의 비율이 부모 세포 보다 내성 세포에서 높았다. Western blot을 통해 carboplatin 내성 세포에서 cyclin D1과 cyclin D3의 발현이 감소하고 p18과 p27의 발현이 증가 하는 것을 확인하였다. 또한, carboplatin 내성 세포에서 약물 유출과 관련된 유전자의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 결론: Carboplatin 내성 세포주 개발은 망막모세포종의 항암화학요법의 저항성 문제를 해결하고자 하는 연구에 활용될 수 있다.