PI(4,5)P2 에 의한 TREK 포타슘 이온통로의 활성 조절에 대한 C-말단 아미노산의 역할

Abstract

TREK (TWIK-related two-pore domain K+ channel)은 background-type K+ 채널 단백이며, 안정막 전압 형성과 흥분성 세 포의 재분극에 관여한다. TREK 은 막전압 의존성은 없으나, 세포막 PI(4,5)P2, 세포 내 pH (pHi), 온도, 불포화지방산, 세포막 신전 등에 의해 활성이 조절된다. 세포막 안쪽의 TREK C-말단이 다양한 자극들 에 의한 활성 조절을 매개한다고 알려져 있다. 특히, TREK 활성 조절 에 C-말단 근위부의 전하를 띈 아미노산들이 매우 중요하다고 알려졌 으나, 정확한 위치와 조절 방향은 명확하지 않다. TREK 은 낮은 활성 상태를 바탕으로 다양한 자극들에 의해 활성이 증가된다. 이를 통하여 세포의 막전압을 조절하는 기능을 담당한다. TREK 의 흥분성 조절에 대한 연구들은 많으나, 억제성 조절 기전 및 이와 관련된 C-말단의 세부 구조는 알려져 있지 않다. 이 연구는 C-말단의 음성 및 양성 아 미노산들 중, PI(4,5)P2 와 pHi 의존적 조절을 담당하는 잔기들을 발견 하고, 그 조절 기전에 대한 새로운 제안을 목적으로 수행하였다. 1) Whole-cell 막전압 고정법으로 TREK 전류(ITREK, w-c) 측정뿐만 아니 라, inside-out 조건 측정(ITREK, i-o)에서도 세포 내 ATP (1-3 mM)는 TREK 활성을 감소시켰다. PI-kinase 억제제(Wortmannin)는 ATP 에 의한 ITREK, i-o 억제를 방지하였고, PI(4,5)P2 자체는 ITREK, i-o 를 강력히 억제하였다. 따라서 AT 는 PI-kinase 의존적 PI(4,5)P2 합성을 통하여 TREK 을 억제하는 것으로 사료된다. 그런데, PI(4,5)P2 를 탈 인산화 시키는 voltage sensitive phosphatase 를 TREK-2 와 공발 현 시킨 후 PI(4,5)P2 를 탈인산화하면, ITREK, w-c 는 처음에는 증가하 지만, 이어서 다시 억제되었다. ITREK, i-o 측정 시 poly-L-lysine (PLL) 투여로 PI(4,5)P2 로 인한 음성막지질을 중화 시키면 ITREK, i-o 는 완전히 억제된다. 이 상태에서 PI(4,5)P2 를 점차 높은 농도로 처 ii 리하면, ITREK, i-o 은 단계적으로 증가하다가 억제되어서, PI(4,5)P2 농 도에 따른 양방향성 조절을 시사한다. 즉, PI(4,5)P2 의 존재는 TREK 활성에 필수적이지만, 생리적 농도에서는 TREK 활성을 낮게 유지하 고 있다. PI(4,5)P2 생성을 매개로 하는 세포 내 ATP 의 TREK 활성 억제는 내인적으로 TREK 을 발현하는 성상교세포와 B 림프구에서도 확인되었다. 2) TREK 의 C-말단 근위부, 특히 사람의 hTREK-2 기준으로 323-361 번 잔기들에 양전하성(cationic) 아미노산이 많이 존재하여 PI(4,5)P2 의 정전기적 영향을 매개할 가능성이 높다. 330 번 Lys 을 Ala 으로 치환(K330A) 하였더니, K330A ITREK-2, i-o 는 이미 높은 활성을 보 였으며, ATP 에 의한 활성 억제와 세포 내 산성화에 의한 활성 증가 가 나타나지 않았다. Whole-cell 막전압 고정 조건에서도, K330A ITREK-2, w-c 은 이미 높은 활성을 나타내면서, 아라키돈산, 2-APB, 산성 pHe 에 의한 추가적인 활성 증가가 덜 나타났다. TREK-1 의 상 응 잔기 치환 (K315A)도 동일한 변화들을 유발했다. TREK-2 K330 이나 TREK-1 K315 는 세포 내 ATP 가 있는 생리적 조건에서 PI(4,5)P2 를 매개로 TREK 활성을 억제하는데 중요한 것으로 생각된 다. 흥미롭게도, 이보다 원위부 C-말단 부위에 연속된 세 개 (355￣ 7) 의 Arg 을 Ala 으로 치환(R355￣7A)한 경우, TREK-2 활성도는 평소보다 낮아질 뿐만 아니라, ATP 가 없어도 ITREK-2, i-o 와 ITREK- 2, w-c 는 계속 낮게 유지되었다. 하지만 다른 활성화 자극들(산성 pHi, 2-APB, 아라키돈산)의 효과는 잘 나타났다. 더욱 흥미롭게도, R355￣7A 경우, K330A 를 추가로 도입하더라도 기저 활성이 낮은 상태는 그대로였고, 2-APB 나 산성 pHi 에 의한 활성화는 여전히 잘 나타났다. 이 결과들로부터, K330 은 상대적으로 높은 농도의 PI(4,5)P2 에 의한 억제를 매개하고, R355￣7 은 낮은 농도의 PI(4,5)P2 에 의한 활성화를 매개하는 것으로 추정되었다. iii 3) 산성 pHi 에 의한 활성화에서 TREK-1 C-말단의 Glu (E317)이 중요 하다는 기존의 보고는 있으나, TREK-2 는 제대로 확인되지 않았다. E317 에 상응하는 TREK-2 의 332 번 Glu 을 Ala 으로 치환(E332A) 하면, ITREK-2, i-o 와 ITREK-2, w-c 는 모두 자극과 상관없이 높은 활성 도를 보이며, 산성 pHi 에 더 이상 반응하지 않았다. 흥미롭게도 세 포 내 ATP 에 억제도 나타나지 않았다. TREK-1 과 달리, TREK-2 는 또 다른 C-말단 Glu (E335) 치환(E335A)에도 산성 pHi 에 의한 활성 화가 부분적으로 줄어들었다. 그러나 E335A 는 ATP 에 의한 억제는 여전히 나타났다. 앞서 관찰한 TREK-2 의 R355-357A 에 E332A 를 추가 치환하여도 낮은 기저활성 상태는 그대로였으며, 산성 pHi 에 의한 활성화는 여전히 나타나지 않았다. 본 연구를 통하여, TREK-2 C-말단에서 PI(4,5)P2 에 의한 상반적인 조절 을 담당하는 두 부위의 양전하 잔기들(K330, R355-357)을 새롭게 찾아 내었다. 산성 pHi 에 의한 활성화를 담당하는 E332 의 핵심적 역할과 함께 E335 의 보조적 역할도 발견하였다. R355-357 의 양전하 의존적 작용은 TREK-2 의 기저활성에 필수적이지만, E332 를 매개로 하는 산성 pHi 효과나 다른 활성제들의 작용과는 상관 없는 것으로 나타났다. 보 다 명확한 상호작용 기전을 밝히려면, 향후 C-말단의 정밀한 분자구조 규명이 필요하다.