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고분해능 단백체 프로파일링 및 표적단백체 기술을 이용한 신경-면역 시스템에 대한 기능 단백체 연구
Functional proteomics study for neuro-immune system using in-depth proteome profiling and targeted proteomics techniques

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Authors
우종민
Advisor
김영수
Major
의과대학 의과학과
Issue Date
2018-02
Publisher
서울대학교 대학원
Keywords
중추신경계성상교세포미세아교세포뇌신경세포미세아교세포 활성화분비단백체Dimethyl labelingLabel-free PRM표적단백체학
Description
학위논문 (박사)-- 서울대학교 대학원 : 의과대학 의과학과, 2018. 2. 김영수.
Abstract
서론: 의학의 발전으로 이제는 100세 시대라고 할 정도로 인간의 평균수명은 점차 증가하고 있지만, 노후화로 인해 발생하는 많은 질병 중 Alzheimer disease (AD), Parkinson disease (PD), 또는 Amyotrophic lateral sclerosis (ALS)와 같은 퇴행성 뇌신경 질환은 삶의 질을 감소시키고 있다. 이러한 퇴행성 뇌신경 질환의 원인과 기작에 대한 연구를 진행하기 위해 분자수준에서의 접근이 필수적이며, 고해상도 질량분석기를 이용한 프로테오믹스 기술은 이러한 표지자 단백질 발굴에 매우 유용한 기술로 대두 되고 있다. 또한 표적 단백질 간의 체계적인 네트워크 분석은 향후 퇴행성 뇌신경 질환의 메커니즘 연구에 사용될 수 있을 것이다.


방법: 1장에서 중추신경계 세포들의 분비단백질 분석 최적화와 세포주들간의 단백체 차이를 보기 위해 뇌신경세포주 (HT-22), 성상교세포주 (C8-D1A), 미세아교세포주 (BV-2)를 사용하였다. 1x10e6개의 cell 을 100mm dish에 24시간 배양 후, 농축 시켜 얻은 단백질들을 FASP (Filter Aided Sample Preparation) 기법을 사용하여 펩타이드로 시료처리를 하여 고해상도 질량분석기기인 Q-Exactive로 4시간 분석을 진행하였다. 분석결과 data는 Andromeda 알고리즘 기반의 MaxQuant 프로그램으로 데이터 처리를 하였고 annotation 되지 않은 MS/MS 데이터는 de-novo 기반의 PEAKS-7 프로그램으로 분석하여 추가적인 단백질 동정을 하였다. 각 세포주들의 분비단백질들은 label-free quantitation기법으로 비교분석 하였으며 bioinformatics tool을 사용하여 분비단백질들의 중요한 기능을 확인하였다. 2장에서는 미세아교세포주에 24시간동안 lipopolysaccharide (LPS)와 interferon gamma (IFN-γ)를 처리하여 활성화 시킨 후 intracellular와 extracellular에서의 단백체 차이를 dimethyl labeling기법을 사용하여 동시정량분석을 진행하였다. 6, 12, 24, 48시간동안 LPS, IFN-γ, LPS/IFN-γ 로 활성화 시킨 미세아교세포의 intra-, extracellular에서의 표지자 후보 단백질군에 대해서 변화를 보기 위해 표적 단백체학 기법인 label-free PRM (Parallel Reaction Monitoring) 으로 상대정량을 하여 시간에 따라 변화하는 단백체들의 체계적인 네트워크 분석을 진행하였다.

결과: 1장에서는 고해상도 질량분석기를 사용하여 3가지 세포주에서 2795개의 분비 단백질들을 동정하였으며 각 세포주 당 156개 (BV-2), 44개 (C8-D1A), 93개 (HT-22)의 특이적인 단백질을 발굴하였다. 또한 de-novo sequencing 분석 기법을 사용하여 302개의 추가적인 단백질들을 ID 하였다. 발굴한 분비단백질들의 신뢰도를 높이기 위하여 SignalP, SecretomeP, Exocarta, TMHMM database tool을 이용하여 2351개의 잠재적 분비단백질들을 분류하였고, 정량비교분석 기법을 통해 각 세포주 분비단백질들간에 2 fold change의 차이를 보이며 student t-test에서 p-value 0.05이하의 유의수준을 보이는 단백질 573개 (BV-2 vs. C8-D1A), 694개 (BV-2 vs. HT-22), 475개 (C8-D1A vs. HT-22) 를 확인하였다. 또한 정량된 단백질들의 pathway 분석을 통해 lysosome, phagocytosis 등과 같은 분비 단백질들의 중요한 기능을 확인하였고, Parkinson disease, Huntington disease와 같은 퇴행성 뇌신경 질환과도 연관이 있는 단백질들을 발굴하였다. 2장에서는 LPS와 LPS/ IFN-γ 로 활성화 시킨 모델의 세포내 단백체 (WCP) 분석을 통해 5492개 단백질을 동정하였고 4748개의 단백질을 정량 할 수 있었으며 동일 모델의 세포외 분비단백체 (SEC) 분석을 통해 4938개 단백질 동정 및 3558개 단백질을 정량 할 수 있었다. 디스커버리 수준의 분석을 통해 유의한 차이를 보이는 단백질들 과 KEGG pathway 등 bioinformatics 분석을 통해 319개의 세포내단백질, 170개의 분비단백질을 최종 타겟 후보군으로 선정하였다. 450개 이상의 peptide를 동시정량분석이 가능하도록 최적화 시킨 label-free PRM 기법을 사용하여 미세아교세포 활성화 시간대별로 모은 시료에서 표적단백체학 분석을 진행한 결과, 시간대 별로 변화하는 pathway 네트워크 지도를 그릴 수 있었으며 활성화 미세아교세포 모델에서 세포내와 세포외에서 차이를 보이는 표지자 단백질 후보군을 제시 할 수 있었다.

결론: 1장에서는 분비단백체 기법의 최적화 및 개발을 통해 3가지 세포주들의 분비단백질 차이를 label-free quantification 기법으로 확인하였다. 이러한 분비단백체학 기법은 적은 양으로 존재하고 있는 세포외 단백질들을 심도 있고 정확하게 연구를 할 수 있는 기반을 마련하였다. 2장에서는 단일플랫폼에서 체계적인 정량 프로테오믹스 접근법을 통해 중추신경계 안에서 면역을 담당하고 있는 미세아교세포의 활성화 시 발현하는 표지자 단백질을 발굴하여 퇴행성 뇌신경 질환 메커니즘 연구에 도움을 주고자 하였다. 보다 정밀하고 정확한 정량 분석을 위하여 dimethyl labeling 동시 정량 기법과 label-free PRM 표적단백체학 기법을 확립하였고, 미세아교세포의 활성화 시에 면역-염증 반응과 신진대사에 관련한 단백질들의 변화를 하나의 플랫폼으로 정량 분석하여 LPS와 IFN-γ 특이적으로 발현의 차이를 보이는 표지자 단백질들을 발굴 할 수 있었다.
Language
Korean
URI
https://hdl.handle.net/10371/141000
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Appears in Collections:
College of Medicine/School of Medicine (의과대학/대학원)Dept. of Biomedical Sciences (대학원 의과학과)Theses (Ph.D. / Sc.D._의과학과)
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