대식세포의 염증 반응에 대한 GPR40 리간드의 양극성 효과

Abstract

지방산은 에너지원으로 이용될 뿐만 아니라 수용체의 리간드로도 작용한다. 최근 연구에서 이들을 내인성 리간드로 인지하는 GPCR family가 밝혀졌다. 이 중 Long chain fatty-acid를 리간드로 갖는 GPCR은 GPR40과 GPR120이 알려져 있다. GPR40은 주로 이자의 베타세포나 장내분비 세포(enteroendocrine cell)에 많이 발현되어 있다. 반면 GPR120은 대식세포에 많이 발현되어 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 long chain fatty-acid의 대식 세포에 대한 영향에 대한 연구는 주로 GPR120에 초점이 맞춰져 있다. 반면, GPR40 자극이 대식 세포에 미치는 영향에 대한 연구는 미흡한 상태이다. 본 연구에서는 먼저 대식 세포에서 GPR40의 발현을 측정하고, GPR40의 선택적 리간드인 TAK-875, AM-837, AM-1638을 이용하여, GPR40 선택적 리간드의 염증 반응에 대한 역할을 평가하였다. 우선 잘 알려진 단구/대식세포주인 Raw264.7, J774.A1 세포 및 일차배양 면역세포의 GPR40 발현 여부를 확인하였다. 기존에 알려진 바와 달리 이들 세포에서 GPR40 mRNA의 발현이 확인되었다. 염증 반응에 대한 GPR40 리간드의 작용을 살펴보기 위하여 lipopolysaccharide(LPS)와 GPR40 리간드 3종을 Raw264.7 세포에 처리하였다. GPR40 리간드 처리에 따라 염증성 인자인 iNOS의 발현 감소를 확인하였으며, 이 때 TAK-875가 가장 강한 억제 작용을 보였다. 또한 TAK-875 처리시 염증성 cytokine인 IL-6, chemokine인 MCP-1의 발현 감소도 확인하였다. 한편 GPR40 antagonist인 GW1100 처리 시, TAK-875에 의한 iNOS 발현 억제가 역전되지 않았다. 따라서 GPR40 리간드에 의한 iNOS 감소 반응은 GPR40을 경유하는 작용이 아니라, TAK-875 화합물의 구조적 특성에 기인한 작용으로 보인다. iNOS, IL-6, MCP-1 등의 염증 단백질의 발현을 공통적으로 조절하는 전사인자로 NF-B가 알려져 있다. 따라서 가장 강한 항염증 효과를 보인 TAK-875를 이용하여, NF-B의 활성화에 대한 영향을 평가하였다. TAK-875를 전처리한 뒤 LPS를 처리하여 염증 반응을 유도한 뒤, NF-B 활성 조절의 상위 단백질인 IB, IKK 의 인산화를 확인하였다. 하지만 TAK-875에 의한 유의적인 변화는 관찰되지 않았다. 또한 p65의 핵질 이동에도 영향이 없는 것을 확인하였다. 따라서 TAK-875에 의한 항염증 효과는 NF-B pathway와 무관한 반응으로 생각된다. 흥미롭게도, J774.A1 세포를 이용하여 동일한 실험을 시행했을 때, iNOS의 감소가 관찰되지 않았다. J774.A1 세포의 GPR40 리간드에 의한 항염증 반응성 감소의 원인을 살펴보기 위하여 Raw264.7 세포와 J774.A1 세포의 기질적 상이점에 주목하였다. Raw264.7 세포는 inflammasome 구성 요소 중 하나인 ASC가 결손된 세포임이 알려져 있고, 실험을 통하여 이 사실을 확인하였다. 또한 Raw264.7 세포에 LPS/ATP 처리로 NLRP3 inflammasome을 활성화 했을 때에도 IL-1가 방출되지 않는 것을 확인하였다. 반면 J774.A1세포는 LPS/ATP 처리시 IL-1가 방출 되는 것을 확인하였으며, 특히 LPS 처리 이후 TAK-875 처리 시에도 IL-1가 미약하게 증가하는 것을 확인하였다. IL-1 또한 iNOS 등의 염증 단백질 발현을 유도하므로, TAK-875에 의하여 발생한 IL-1가 항염증 반응성 감소의 원인이 될 수 있다. 또한, GPR40 리간드가 NLRP3 inflammasome 활성 증폭에 영향을 주는지 확인하기 위하여, LPS 처리 후 ATP와 함께 GPR40 리간드를 동시 처리하였다. GPR40 리간드 처리군에서 현저한 IL-1의 방출 증가와 함께 IL-1의 활성화에 영향을 주는 cleaved caspase-1의 발현 증가를 확인하였다. 또한 pyroptosis 마커인 LDH 방출과 활성형 gasdermin-D의 증가를 확인하였다. 따라서 J774.A1 세포에서 GPR40 리간드가 NLRP3 inflammasome 반응 증폭을 통한 염증 증폭 효과를 일으킴을 보였다. 반면, LPS/ATP 조건에 TAK-875를 추가적으로 처리하였을 때, 골수유래 수지상세포를 대상으로 하는 실험에서는 유의한 변화가 나타나지 않았고, 일차배양 대식세포 및 Kupffer cell를 대상으로 하는 실험에서는 오히려 NLRP3 inflammasome 반응이 감소한 결과를 보였다. 따라서 면역세포마다 GPR40 자극에 따른 NLRP3 inflammasome 반응 양상이 다르다는 결론을 내렸다. 본 연구에서는 단구/대식세포주와 일차배양 면역세포에서 GPR40의 발현을 보였다. 또한, inflammasome 구성요소인 ASC가 결손된 Raw264.7 세포 및 일차배양 대식세포에서 GPR40 리간드가 항염증 효과를 보이는 것을 보였다. 한편, J774.A1 세포에서는 항염증 효과는 미미하였고, 오히려 NLRP3 inflammasome 활성 증폭을 통하여 염증 반응을 매개할 수 있음을 확인하였다. 따라서 TAK-875가 대식 세포의 염증 반응에 대하여 양극성 반응을 보일 수 있음을 제시하였다. 하지만 실제 in-vivo 조건에서 어떤 반응이 나타나는지, 어떠한 조건에서 항염증 반응과 염증 반응이 차별적으로 나타나는 지에 대한 후속 연구가 필요하다.